Clonado molecular Flashcards
cual es la diferencia entre clonado y clonado molecular?
clonar es hacer una copia identica de algo, no importa que. el clonado molecular refiere a generar copias identicas de una molecula de adn o un tramo de adn
como se realiza el clonado molecular?
se une un fragmento de adn (inserto) de forma in vitro a un vector con capacidad de replicarse de forma autonoma en una celula huesped. Luego esto permite aislar y amplificar el fragmento de interes
qué vector puedo elegir segun el tamaño de mi inserto?
-plasmidos para inserto de 5-10kb
-fago lambda para inserto de 10-20kb
-cosmidos para insertos de 35-45 kb
-bacteriofagos para insertos de 70-100 kn
BAC para insertos de 100-300kb
-YAC para insertos de 0,2-2 mn
que huespedes pueden incluir al vector y como se inserta?
-bacterias: incluyen el vector por transformacion, conjugacion o infeccion
-levaduras: incluyen el vector por transfeccion
-cel animales: transfeccion, electroporacion, virus, microinyeccion en nucleo
-cel vegetales: electroporacion, microinyeccion, T-DNA
como se diferencian e coli, lineas celulares de mamiferos y levaduras como huespedes?
e coli no realiza modificaciones post traduccionales ni post transcripcionales, mientras que las cel de mamiferos y las levaduras si. Las levaduras y e coli tienen un crecimiento rapido, y las lineas celulares no.
como se cortan los extremos para la insercion del inserto a vector?
los extremos del inserto y del vector deben ser compatibles para el clonado.
si se corta con una unica enzima de restriccion, los extremos de ambos van a ser iguales y el inserto se va a dirigir en cualquier direccion. para evitarlo, se pueden usar dos enzimas de restriccion diferentes
Una vez unidos, se sellan las hebras con la ADN ligasa
que elementos componen a un vector plasmidico?
-sitio multiple de clonado /polylinker/sitios de insercion
-origen de replicacion
-marcador de seleccion
-marcador de recombinacion o integracion del adn al plasmido
como se inserta una secuencia en los fagos?
se corta tanto el vector como al adn de interes con enzimas de restriccion. (si varios fragmentos de diferentes tamaños surgen del adn pueden aislarse por peso molecular los de interes). Luego se une a las dos porciones del vector con la porcion de adn de interes con ligasa, y se obtienen concatámeros (ej brazo izq-adn int-brazo der-brazo izq-adn int
Se cliva el concatamero in vitro y los fagos incuyen las porciones. se colocan en placas de lisis
SOLO SE GENERAN CICLOS LITICOS AL INFECTAR AL HUESPED
que son los cosmidos? como se cinluye el adn de interes en ellos?
los cosmidos son plasmidos donde los sitios cohesivos del adn estan ligados. el concatámero formado tiene sitios cos, el adn de interes y la secuencia del plasmido. Para empaquetar el adn en los fagos se reconocen las secuencias cos
como estan compuestos los BACS?
Cada BAC tiene un elemento CMR que es un marcador de seleccion de resistencia a clorafenicol, elementos oriS repE parA y parB que permiten replicar y regular el numero de copias, y la secuencia de clonado que tiene un sitio cosN derivado de un fago, los sitios de corte HindIII y BamHI donde se inserta el ADN, los promotores para transcribir el inserto y sitios NotI para extraer el inserto.
que elementos componen a los YACS?
-centromeros
-telomeros
-origen de replicacion
-marcadores de seleccion
-sitios de reconocimiento de enzimas
El adn de interes se inserta con ligasa en el sitio de clonado
Primero la secuencia se amplifica como plasmido en bacterias y luego se inserta en levaduras.
Los marcadores de seleccion se encuentran en brazos distintos del cromosoma, el marcador de recombinacion contiene al sitio de clonado en el medio
en que se diferencian una biblioteca de ADNg y una de ADNc?
-ADNg: coleccion que contiene al menos una copia de todas las secuencias contenidas en el genoma, en forma estable, en un numero manejable de clones. Los clones no pueden EXPRESARSE en procariotas, producen proteinas en cel eucariotas. sirve para analizar genes
-ADNc: coleccion donde estan representados todos los ARNm bajo forma de ADNc de un tipo celular, en un omento determinado, en forma estable, en un numero manejable de clones. Permite la produccion de proteinas euccariotas en bacterias. Solo permite analizar secuencias codificantes
como es el clonado del adn genomico?
a partir de la muestra de nucleos celulares se hace una lisis, extraccion de adn y una digestion parcial con nucleasas. luego se van solapando los fragmentos para ir armando la secuencia que se quiere unir al vector. Cada fragmento se une a un vector, y cada plasmido conteniendo una porcion del genoma que se solapa con otro forma la biblioteca de ADNg
como se obtiene ADN copy?
a partir de una muestra de células lisadas se aisla el ARN total y luego se pasa por una columna cromatografica que contiene cadenas de T para unirse a las colas poli A del ARNm mientras eluye el resto del ARN. Luego se eluye al ARNm con una solucion que rompa el enlace con las poli T
El ARNm aislado se trata con una transcriptasa reversa obteniendo cDNA heteroduplex. Con medio básico se degrada al ARN y a la cadena de ADN formada anteriormente se la trata con ADN polimerasa dando una doble cadena de ADNc, y con una nucleasa para cortar un loop que formo la cadena simple para comenzar la sintesis de la complementaria. A los extremos de la secuencia se ligan sitios de reconocimiento de enzimas de restriccion.
Como se da la seleccion por marcadores nutricionales?
a una bacteria his- se le inserta un plasmido que tiene un marcador his+ (solo produce his el plasmido). si a las bacterias se las incuba en un medio de crecimiento sin histidina, solo crecen las que incorporaron el plasmido, pero no significa que el plasmido tenga el inserto de adn de interes
