BLOQUE III Flashcards
¿Qué es la técnica PCR?
Es una técnica que permite la amplificación de un seguimiento específico del ADN en millones de hebras. Se basa en la capacidad del ADN polimerasa de replicar a ese ADN. Se utiliza ADN poli de microorganismos termoestables, desoxirribonucleósidos trifosfato (dNTPs, formado por bn + desoxirribosa + 3P), cebadores/primers, buffer óptimo y cofactores (Mg2+), ADN molde y un termociclador.
¿Para qué sirve la PCR?
Su objetivo es generar millones de copias de una secuencia de interés a partir de una cantidad muy pequeña de ADN inicial, permitiendo su análisis detallado. Sirve para:
Diagnóstico molecular
Identificación de enfermedades infecciosas: Detección de patógenos como virus (ej. SARS-CoV-2, VIH), bacterias (ej. Mycobacterium tuberculosis), y otros agentes infecciosos.
Detección de mutaciones genéticas: Identificación de mutaciones que causan enfermedades hereditarias, como fibrosis quística o anemia falciforme.
Investigación en genética y biología molecular
Clonación de genes: Generación de copias de un gen para estudios estructurales y funcionales.
Estudio de expresión génica: Convertir ARN en ADN complementario (cDNA) y amplificarlo para medir los niveles de expresión de genes.
Secuenciación del ADN: Amplificación de fragmentos para facilitar su posterior secuenciación.
Forense y pruebas de paternidad
Identificación de personas: Comparación de ADN en investigaciones criminales mediante el análisis de microsatélites o huellas genéticas.
Estudios de parentesco: Determinación de la relación biológica entre individuos.
Estudios evolutivos y de biodiversidad
Análisis de ADN antiguo: Amplificación de ADN extraído de restos fósiles o materiales degradados.
Identificación de especies: Uso en barcoding genético para identificar especies por sus secuencias de ADN.
Control de calidad de alimentos y transgénicos
Detección de ADN de organismos genéticamente modificados (OGMs) en alimentos.
Identificación de patógenos que afectan a productos alimenticios.
Ventajas de la PCR
Alta sensibilidad: Puede detectar una cantidad ínfima de ADN.
Especificidad: Amplifica secuencias específicas con el uso de cebadores (primers).
Rapidez: Proceso que puede completarse en pocas horas.
Cuáles son los pasos de la PCR?
Primero se identifica la porción del ADN que se quiere amplificar, se produce una desnaturalización del ADN para que así se pueda separar las hebras, después lo une al cebador, se hace la elongación de la cadena donde una ADN polimerasa termoestable sintetiza nuevas hebras utilizando los dNTPs como sustrato. La amplificación es exponencial, los ciclos se repiten entre 32 y 40 veces y cuanto más se repite menos ADN tenemos.
¿Cómo podemos identificar si la PCR funcionó?
Para identificar si la PCR ha funcionado, se realiza una electroforesis en gel de los ácidos nucleicos. En este procedimiento, se verifica la presencia del fragmento amplificado y se compara su tamaño con el tamaño esperado. Si se observa una banda en el gel que corresponde al tamaño del fragmento deseado, se concluye que la PCR es positiva. Este análisis se puede realizar en geles de agarosa o poliacrilamida, y para la detección del ADN amplificado se utiliza una coloración fluorescente, que permite visualizar las bandas bajo luz ultravioleta.
Electroforesis: Es una técnica de separación de moléculas cargadas que se basa en el desplazamiento de ellas en un campo eléctrico. Ocurre tanto en condiciones nativas como en condiciones desnaturalizantes. Consiste en la migración de moléculas conforme su peso molecular y su carga. Presenta un ánodo es el polo positivo de la electroforesis, o sea, es el electrodo positivo, a ello migran las cargas negativas como por ejemplo los ácidos nucleicos. Cátodo es el polo negativo de la electroforesis, o sea, es el electrodo negativo, a ello migran las cargas positivas.
¿Qué es la PCR en tiempo real (QPCR - PCR cuantitativa)?
Es una variante de la PCR normal, que permite amplificar y simultáneamente cuantificar de forma absoluta el producto de la amplificación. Son utilizados fluorocromos que se intercalan a la doble hebra de ADN u otros y a cada ciclo de amplificación se mide la fluorescencia. Cuanto más brillo más cantidad de ADN. En el testeo de covid se utilizó esa QPCR.
¿Cómo se hace la QPCR?
En la qPCR, se puede utilizar una sonda en forma de horquilla (también llamada sonda molecular) que contiene una secuencia de nucleótidos complementarios al fragmento de ADN que se va a amplificar. Esta sonda tiene en un extremo un fluoróforo (una molécula que emite luz) y en el otro extremo una molécula apantalladora (quencher), que bloquea la fluorescencia del fluoróforo cuando ambos están cerca. En su forma de horquilla, el fluoróforo no emite luz porque la molécula apantalladora lo “apaga”. Sin embargo, cuando la sonda se hibrida con el fragmento de ADN durante la amplificación, se despliega, alejando la molécula apantalladora del fluoróforo. De esta manera, el fluoróforo emite luz de manera libre, lo que permite detectar en tiempo real la amplificación del ADN a medida que avanza el ciclo. Por lo tanto, cuanto más brillo más fragmentos de ADN presenta.
¿Cómo se da y cómo se interpreta la curva de amplificación de la PCR cuantitativa?
En el gráfico se calcula el CT, o sea, el ciclo al cual la fluorescencia despega de la fluorescencia umbral (es la baseline, donde no se detecta fluorescencia). Cuanto mayor sea el CT menos la cantidad de ADN y cuanto menor sea mayor la cantidad de ADN.
- En los primeros ciclos, la señal está cerca del fondo (ruido basal).
- En los ciclos intermedios, se observa la fase exponencial donde la curva asciende rápidamente.
- Finalmente, la curva se aplana en la fase de meseta, cuando la reacción pierde eficiencia y se agotan los reactivos.
EJ:
La curva 1 llegó al CT en el ciclo 10 aprox
La curva 2 llegó al CT en el ciclo 20
La curva 3 llegó al CT en el ciclo 25
la curva de color negro no presenta carga viral.
Las diferencias en el Ct se deben a la cantidad inicial de ADN. Cuanto más ADN hay al inicio, más rápido se alcanza el Ct, ya que se necesita menos tiempo para que la fluorescencia supere el umbral. Cuanto menor el CT mayor la carga viral.
PCR es la técnica preferida para el diagnóstico de COVID-19 debido a su capacidad para detectar el virus en las primeras etapas de la infección, proporcionando resultados rápidos y precisos. El ELISA, aunque útil para estudios serológicos, no es adecuado para la detección temprana de infecciones activas.
¿Cuál es la diferencia entre la PCR convencional y la PCR en tiempo real?
La PCR convencional realiza la detección del ADN amplificado al final de todos los ciclos, por lo que su resultado es cualitativo: indica si la amplificación funcionó o no, generalmente mediante electroforesis en gel. Por otro lado, la PCR en tiempo real (o qPCR) permite detectar y cuantificar el ADN mientras se lleva a cabo la amplificación, gracias al uso de colorantes fluorescentes o sondas específicas. Esto la convierte en una técnica cuantitativa, ya que permite determinar la cantidad de ADN amplificado en cada ciclo, lo que es útil para medir con precisión la concentración inicial del ADN en la muestra.
Puedo usar un qPCR para determinar la presencia de insulina en plasma?
No, el qPCR no se utiliza para detectar proteínas como la insulina en plasma, ya que esta técnica está diseñada para medir ácidos nucleicos (ADN o ARN). Sin embargo, se puede utilizar en el contexto de medir la expresión de genes relacionados con la producción de insulina o la regulación de su síntesis. Una técnica para medir la insulina en el plasma seria el inmunoensayo.
¿Qué son los inmunoensayos?
Son métodos de detección inmunológicos basados en la interacción específica entre un antígeno y su anticuerpo. Consiste en varias técnicas que identifican y cuantifican a un antígeno o anticuerpo determinado en una muestra compleja.
¿Qué son los antígenos y anticuerpos?
Los antígenos son sustancias que van a estimular la producción de un anticuerpo, conocidos como “cuerpo extraño”. Ej: proteínas de cubierta de los virus, bacterias… Y los anticuerpos son las proteínas producidas por las células B que se unen a los antígenos con gran especificidad. Esa unión marca al antígeno para que sea destruído. El Ac une a la porción denominada epitope del Ag, este puede tener vários epítopes.
¿Cuáles son los inmunoensayos que tenemos?
ELISA, tests rápidos (cinta de flujo lateral), western blot y la inmunofluorescencia.
¿Cuáles son las ventajas y desventajas de los inmunoensayos?
- No determina la presencia de virus circulante
- Período ventana
- No distingue entre infección aguda, crónica o resuelta
- Falsos (-) hemodializados o inmunosuprimidos o período ventana
- Falsos (+) en pacientes con algunas enfermedades o infecciones
- No para niños menores de 18 meses de madres +
- Alta sensibilidad y bajo costo (especialmente combinada con la detección de Ag)
- No requiere mucho equipamiento ni las instalaciones/precauciones de un laboratorio de biología molecular
¿En qué consiste el ELISA?
Se basa en la reacción antígeno-anticuerpo. Esta técnica permite la detección y cuantificación de Ag o Ac utilizando a Ac unidos a una enzima capaz de generar un producto detectable, eses Ac son denominados Ac secundarios.
Cuando se quiere cuantificar al Ag se lo adhiere al soporte (inmunoabsorbente) pero cuando quiere cuantificar al Ac adhiere a ello.
Hay 2 tipos de ELISA:
- ELISA indirecto: es utilizado para detectar un anticuerpo circulante, como al anti-covid, HIV… Se utiliza un pocillo en el cual se coloca un antígeno. Luego se coloca el anticuerpo específico para ese antígeno y estos se unen. Luego se coloca un anticuerpo secundario que está conjugado con una enzima, la cual es capaz de convertir su sustrato incoloro en sustrato coloro (hace color). Entre cada paso hay lavados para eliminar moléculas no deseadas. La velocidad de formación del color es proporcional a la cantidad de anticuerpos específicos. Entonces cuanto más anticuerpo más color.
- ELISA sandwich: sirve para detectar antígeno (Proteínas virales circulantes, hormonas, marcadores tumorales). Se coloca en el soporte (pocillo) un anticuerpo denominado “anticuerpo de captura” el cual es capaz de reconocer el antígeno. Entonces luego se coloca la muestra con el antígeno, se unen, y se coloca otro anticuerpo que se une al antígeno (al epitope). Y por último se coloca el anticuerpo secundario con la enzima que va a llevar a cabo la reacción de color. Entre cada paso hay lavados también. Entonces cuanto más color más antígeno hay en la muestra.
¿Qué aplicaciones clínicas tiene el ELISA?
Diagnóstico de infecciones por microorganismos, al detectar la presencia de antígenos del agente infeccioso Confirmación de la presencia de anticuerpos, pueden ser anticuerpos contra cualquier microorganismo, inclusive vacunas, anticuerpos, etc. Cuantificación de metabolitos, hormonas, medicamentos, etc.
Ej: En mujeres embarazadas Medición de HCG-cualitativa y cuantitativa, Toxoplasmosis (Inmunoglobulinas), Rubéola (Inmunoglobulinas), HIV y CMV. También para Diagnóstico de SARS-Cov2, HIV y Monitoreo de hormonas-tratamiento.
