Análisis de ac. nucleicos

Question 1

Es el primer paso para los estudios de biología molecular y para las técnicas de DNA recombinante, secuenciación, mutagénesis.

Answer 1

Extracción del DNA -> medicina forense, nanotecnología de DNA

Question 2

¿De qué depende la elección del método de extracción del DNA?

Answer 2

Del tipo de ác. nucleico que se va a extraer, del organismo de origen de esos ác. nucleicos (prok, plantas, virus), de la fuente del ác. nucleico (sangre, suero, orina, LCR) y de la técnica en que se utilizará el ac. nucleico extraído

Question 3

Menciona algunas fuentes de ácido nucleico

Answer 3

Sangre, suero, plasma, biopsia, orina, LCR, raspado bucal, LA, folículo capilar, etcétera

Question 4

Pasos para la extracción del DNA

Answer 4

-Lisis de las células y liberación del DNA
-Extracción de proteínas y lípidos con solventes orgánicos
-Precipitación de DNA
Sal salina saturada -> desnaturaliza proteínas
-Lavado de DNA con agua

Question 5

Estudio que mide la cantidad de intensidad de luz absorbida después de pasar a través de una solución muestra

Answer 5

Espectrofotometría -> Mide la longitud de onda y la concentración o reacciones químicas que se miden en una muestra.

Question 6

Mientras más luz absorba menos concentración. V o F

Answer 6

FALSO -> Mientras mas luz absorba mayor concentración
 DNA y RNA absorción: 260nm
 Proteínas: 280nm
 Fenol: 270

Question 7

Unión específica de colorantes fluorescentes al ácido nucleico

Answer 7

Fluorometría

Question 8

¿Qué es la fluorometría?

Answer 8

 Unión específica de colorantes fluorescentes al ácido nucleico
 Absorbe la luz a una determinada longitud de onda y emite una longitud de onda superior.
 La concentración es proporciona a la intensidad de emisión fluorescente

Question 9

Colorante utilizado en fluorometría

Answer 9

Hoechst 33258

Question 10

¿Qué son las pruebas de PCR?

Answer 10

Reacción en cadena de la polimerasa son una forma rápida y muy precisa de diagnosticar ciertas enfermedades infecciosas y cambios genéticos. Las pruebas detectan el ADN o el ARN de un patógeno

Question 11

¿Qué se necesita para realizar una PCR?

Answer 11

-Secuencia de DNA
-Enzima DNA polimerasa
-Desoxiribonucleotidos (dNTP)
-Primers -> se colocan ya hechos

Question 12

Es el fragmento de DNA que contiene el gen a buscar

Answer 12

DNA templete

Question 13

Usamos proteína de esta bacteria para aguantar temperatura del termociclador

Answer 13

Thermus aquaticus (Taq)

Question 14

Principal enzima que se utiliza para amplificar secuencias del genoma humano

Answer 14

Taq polimerasa

Question 15

Función del cloruro de magnesio

Answer 15

Es cofactor de la Taq polimerasa

Question 16

Características que deben tener los primers

Answer 16

-Son diseñados por el investigador, buscando que sea complementario a la secuencia buscada
-Son cortos y proporcionan extremo 3´
-Alto contenido en C y G (3 puentes de H+)

Question 17

Es una solución amortiguadora necesaria para que la Taq polimerasa haga su función

Answer 17

Buffer / Cofactor

Question 18

Fases de la PCR (3)

Answer 18

Desnaturalización
Hibridación
Extensión o Elongación

Question 19

¿Qué ocurre en la desnaturalización?

Answer 19

-Se separan las cadenas DNA a 95ºC (20 a 30 seg)
-Se rompen puentes de H+

Question 20

¿Qué ocurre en la hibridación?

Answer 20

Fase donde los primers se alinean al extremo 3´ del templado previamente separado e hibridan con su secuencia complementaria
-> Tm 50°C a 60°C (temp de alineamiento del termociclador)

Question 21

¿De qué depende la temperatura en la fase de hibridación?

Answer 21

Depende de los primers

Question 22

Fórmula para estimar la temperatura melting o de hibridación

Answer 22

Tm = 4 (G+C) + 2 (A+T)

Question 23

¿Qué ocurre en la extensión?

Answer 23

Fase en la que la Taq polimerasa actúa sobre el complejo templado-primers y empieza a agregar dNTP´s complementarios para crear las cadenas completas de DNA

Question 24

Fase en la que Taq polimerasa pone nt

Answer 24

Extensión

Question 25

Temperatura óptima para la reacción de extensión

Answer 25

72ºC

Question 26

¿Cuántas ciclos tiene una PCR?

Answer 26

de 30 a 40 ciclos 1er ciclo con un cadena de DNA tengo 2 4 ciclos = 8 DNA | Multiplicar por 2

Question 27

¿Qué hacemos al final de la PCR?

Answer 27

Se realiza un gel de electroforesis

Question 28

¿Qué es la electroforesis?

Answer 28

Técnica mediante la cual se separan las biomoléculas en disolución cuando se ven sometidas a un campo eléctrico

Question 29

¿Qué se necesita para la electroforesis? | qué genera

Answer 29

Cámara de electroforesis Genera campo eléctrico alrededor de un gel La cámara cuenta con dos polos que se conectan a una fuente de energía

Question 30

¿Para qué sirve la corriente eléctrica en la electroforesis?

Answer 30

Para mover las moléculas y que se separen a través de un gel

Question 31

¿Qué función tienen los poros del gel?

Answer 31

Actúan como un colador, permitiendo que las moléculas más pequeñas se muevan más rápido que las grandes

Question 32

Función del gel de agarosa

Answer 32

Se usa para separar moléculas en función de su carga, tamaño y forma. Se trata de un medio de separación especialmente eficaz para las biomoléculas cargadas como el ADN, el ARN y las proteínas

Question 33

Es un polisacárido extraído de algas marinas

Answer 33

Gel de agarosa -> separar fragmentos de DNA, que van de 100 pb a 25 kb -Genera poros

Question 34

Caract. de los poros

Answer 34

-El tamaño de los poros de la matriz del gel depende de la concentración de agarosa utilizada -La concentración de agarosa es inversamente proporcional al tamaño del poro obtenido

Question 35

Caract. de RPC estándar

Answer 35

Amplificación de un segmento de DNA utilizando dos partidores -> se detecta la amplificación es mediante geles de agarosa

Question 36

Aplicación del RPC estándar

Answer 36

Detección **cualitativa** de un segmento de DNA, si lo tiene o no

Question 37

Caract. de RCP múltiple

Answer 37

Amplificación de 2 o más segmentos de DNA utilizando varios partidores en una sola reacción de amplificación

Question 38

Aplicaciones de RCP múltiple o multiplex

Answer 38

Detección cualitativa de varios segmentos de DNA en una sola reacción de RPC -> dif virus o segmentos en una sola muestra

Question 39

Caract. de RPC-RFLP (Restriction fragment length polymorphisms)

Answer 39

RPC estándar con paso posterior de digestión con enzimas de restricción

Question 40

Se usa en la detección de polimorfismos genéticos (SNPs)

Answer 40

RPC-RFLP

Question 41

Caract. de la RT (Reverse transcriptase) -RPC

Answer 41

Síntesis de cDNA a partir de RNA mediante transcripción reversa, seguido de una RPC

Question 42

Se utiliza esta PCR para detección de virus RNA

Answer 42

La RT - RPC -> al hacer transcriptasa reversa podemos detectar RNA

Question 43

Caract. de RPC - TR (Real time) qPCR

Answer 43

-Es CUANTITATIVA -PCR estándar donde se utilizan tinciones o sondas con fluróforos para la detección de los fragmentos amplificados -Cambian los primers y polimerasa, no podemos esperar productos tan grandes (40-60 pares de bases)

Question 44

Aplicaciones del RPC-TR (Real time)

Answer 44

-Detección cualitativa de uno o varios segmentos de DNA -**Cuantificación** de DNA en la muestra (cargas) o expresión de genes (asociada a una reacción de transcripción reversa) -Para ver cuánto virus, RNAm tenemos

Question 45

Qué prueba usar de PCR si mi paciente tiene UN solo virus y ¿por qué?

Answer 45

-PCR en tiempo real pues es más sensible para pequeñas cantidades -Ideal para hacer diagnóstico -> método más sensible para detectar y cuantificar los ácidos nucleicos

Question 46

¿Qué es una sonda fluorescente?

Answer 46

Secuencia de nucleótidos del gen de interés

Question 47

dar vuelta a flash y aprender

Answer 47

La sonda es secuencia de nt adentro del gen Hago secuencia de nt que la pueda complementar A la hora de hacer la PCR, tengo primers y la sonda que diseñé que se complementa a esa gen Le pongo fluoroforo e inhibidor del mismo -> no quiero que se encienda, al estar unidos está inhibido Cuando sea la temp de alineamiento se va a pegar los primers y la sonda En la temp de extensión se van agregando nt; hasta que llega a donde está la sonda y lo que hace es quitar la sonda y sigue poniendo nt, el fluroforo se activa y manda señal que detecta la computadora

Question 48

En una reacción de qPCR, a medida que los cebadores y la ADN polimerasa duplican la cadena molde, ¿Qué ocurre?

Answer 48

SYBR Green se une al ADN de doble cadena a medida que se forma.