Amplifikation: PCR, qPCR Flashcards
SIe haben einen in Wasser gelösten DNA Einzelstang. Was müssen Sie hinzufügen, um einen komplementären Strang zu synthetisieren?
- dNTPs
- Primer (up und down)
- Puffer
- DNA-Polymerase
Welche zwei Erfindungen machen es möglich, dass die PCR kostengünstig und effektiv in jedem Labor eingesetzt werden kann?
- synthetisierte Oligonukleotide
- temp. stabile Polymerase (Taq-Polymerase)
ORF von GFP wurde amplifiziert und neben E. coli Promotor in Vektor kloniert. In transformierten Bakterien kann keine Fluoreszenz entdeckt werden. Welche Typen von Mutationen können in der PCR passiert sein?
- Frameshift-Mutation
- Punktmutation
- (non-sense Mutation)
Welche Mutation ist die wahrscheinlichste?
Punktmutation ist sehr wahrscheinlich, da nur ein Basenpaar ausgetauscht werden muss. Um den Leserahmen zu verschieben muss ein Basenpaar hinzugefügt oder verlohren werden.
Wie würden sie beweisen, dass eine Mutation und kein Problem mit dem Bakterienstamm vorliegt, der zur Expression genutzt wurde?
Das Plasmid könnte aus Bakterien extrahiert werden und sequenziert werden. Ist eine Punktmutation oder Frameshift-Mutation vorhanden wird man dies in der Sequenz sehen können.
Der “cycle threshold” ist:
PCR-Zyklus bei dem der Hintergrund überschritten wird
Ein PCR-Zyklus besteht aus:
- Denaturierung
- Primer Annealing
- Elongation
Nach vier Zyklen sind wie viele Moleküle vorhanden wenn man mit einem DNA-Duplex angefangen hat?
16 Doppelsträngige (1*2^4)
Ein Primer ist 18 Basen lang; Wie häufig wird er ans menschliche Genom binden?
(3,3*10^9)/(4^18) : (länge des Genoms)/(Kombinationsmöglichkeiten der Basen in 18 Basen langem Primer)
Sie wollen eine 22,345 Bsenpaar-lange Region des MAusgenoms mit PCR amplifizieren. Sie erstellen Primer mit 20 bzw 22 Basen Länge, die identische Schmelztemperaturen haben. Es gibt nach der Reaktion leider kein Amplifikat. Warum?
Die Zielregion ist zu lang (max 10000 Basen)
Ideale Temperatur für Taq-Polymerase
72°C
Welches dieser Reagenzien sind typischerweise nicht Teil einer PCR Reaktion? NTPs MgCl_2 Ethidium bromide DNA Primer E. coli DNA Polymerase
- NTPs
- Ethidiumbromid
- E. coli Polymerase
Was würden sie erwarten, wenn Sie in einer PCR die Annealing Temp. erhöhen und die Elongationsphase verlängern?
Präzision und Ertrag sind erhöht
Was würden sie erwarten, wenn man in einer PCR Primer verwendet, die etwas kürzer sind und einige variable Stellen aufweisen?
PCR würde Mixtur unterschiedlicher Produkte ergeben
Elongationsaktivität der Taq-Polymerase
- erzeugt Phosphodiestherbindung
- ist Primerabhängig
