8. Técnicas de biología molecular Flashcards
Sirve para diagnósticos de bacterias o virus
PCR en tiempo final
Proceso de PCR en tiempo final
Proceso de termociclado, se toman fragmentos de 200 pb para que se vea.
Con temperatura elevada (94) se separa, baja temperatura se unen primers (72°), baja temperatura y se une polimerasa, termina ciclo y todo de nuevo
dNTPs
Nucleótidos de óxidos para que la polimerasa arme el ADN, se encuentran libres en la prueba PCR
Enzima taqpolim
Taq polimerasa, aguanta la temperatura para que funcione
Ciclos en PCR de termociclado
Normalmente 40 ciclos.
Entre más energía libre de gibbs es la probabilidad de que sí se amplifiquen
Después de PCR qué haces
Electroforesis, tiene que ser del tamaño que diseñaste, se utilizan marcadores de peso molecular para saber
Bromuro de etidio
Carcinogénico, se une intercalado en el DNA, es lo que brilla
RFLP
Fragmentos de restricción de longitud polimórfica
Cómo funciona la RFLP
Enzimas de restricción que cortan el ADN, cortan secciones palindrómicas
Eco: ecoli
R: rest
1: 1°
Pones la sección en donde está la mutación, si no está sólo una línea, si está 2, si tienes una y una 3
Prueba para anemia falciforme
RFLP:
mutación específica, glu por val
RFLP con 3 alelos
Te ayuda a determinar el genotipo que tienes
Puede ser 1/1, 1/2, 1/3, 2/2, 2/3, 3/3
Prueba para diagnóstico de Huntington
RFLP
Con cada replicación aumenta el número de repeticiones, va a ser más pesada la cadena.
Normal: 18 repeticiones
Mutante: 48 repeticiones
Microsatélites
DNA satélite no codifica pero es útil para identificar
Para qué sirven los microsatélites
Determinar quién se quedó con qué parte del DNA
DNA fingerprinting
Se usan microsatélites del DNA que quieres comparar con otros DNAs sospechosos.
Ej: papá o asesino
Southern Blot
Lee DNA, ayuda a detectar mutaciones en caso de que no haya un sitio específico de corte para la mutación
Proceso de southern blot
Se pone el DNA con enzimas de restricción (endonucleasa), se hacen fragmentos, se electroforisa, se pone en un gel y se pasa a un papel de nitrocelulosa, se lava y se pone con un isótopo radioactivo con DNA complementario al gen de interés, se toma una placa y se obtiene el resultado
rt PCR
Semicuantitativo: te mide pixeles, dice si hay más pero no cuánto más
Ayuda a medir niveles de RNA por la transcriptasa reversa
qPCR
Cuantitativa
BHQ: quita luz
R: brilla
También se puede hacer RT-qPCR
Proceso de qPCR
Se toman los datos del amplification plot, se convierte en curva estándar de cantidad, y se hace una melt curve, después se toma la expresión de cada gen, se cuenta y se obtiene el resultado
Quién quita la luz en el qPCR
el quencher (blackhole quencher)
Prueva COVID PCR qué PCR es
PCR cuantitativa
qPCR
Northen blot
Ve RNA, detecta expresión del gen, es semicuantitativo
Proceso Northen blot
Se mete el RNA, electroforesis, se pasa a un filtro y se pone un isótopo radioactivo, se pasa el filtro y se toma una placa
Control del northen blot
Expresión de actina, para que veas que fue igual en todos
Microarreglos
Se ponen arreglos en una placa de pozos y se ponen muestras de dos RNA, se hace transcripción reversa y se compara el DNA generado por los dos
Puede ser de dos RNA separados o un RNA pero en distinto tiempo
Western blot
Detecta proteínas, tamaño en kDa (kilodaltons), es de lo más usado en el mundo.
Las proteínas pueden ser+,-,o
Gel : poliacrilamida, bisacrilamida, son neurotóxicos
Tinción: azul de coomasie
Semicuantitativo
Proceso western blot
Se ponen las proteínas, se pasan a un filtro, se exponen a anticuerpos (1° se une, 2° peroxidasa de rábano),
Luminol funciona hasta que actúa la peroxidasa, es lo que se ve en la foto gris
Lo rosa: rojo de Punzau
Se usa mucho en VIH
Western Blot
Electroforesis en segunda dimensión
Se tiñen con plata, dependiendo del pH y pK, las proteínas se quedan en un momento de la hoja, por lo que se pueden separar proteínas específicas
ELISA
Semicuantitativa: puede ser directa, indirecta o sándwich
En la directa no se puede usar suero del paciente
Se hace en tripletes
Dot blot
Elisa + western blot
Proceso dot blot
Se pone la proteína, se une a membrana, se meten anticuerpos, se da un color
Es semicuantitativa
Secuenciación
Se compara DNA de base/referencia con un DNA de una persona para detectar mutaciones
Proceso de secuenciación
Fragmentación de DNA, se hace PCR, cada nucleótido da una señal, se hace un electroforograma
Es más específica pero más cara
Electroforograma
Secuenciación, fragmentos de DNA ampliados por PCR, cada nucleótido da una señal
El electroforograma es la manera en que se muestran los resultados de la secuenciación
Anomalías cromosómicas
Deleción, duplicación, inversión, sustitución, traslocación
Pruebas de citogenética
Sirven para ver el cariotipo, se ven en blanco y negro, se hace una tinción
ALL: leucemia linfoide aguda
En el cariotipo se ve el cromosoma filadelfia: sustitución 22/9 (traslocación)
Citogenética más utilizada
Bandas G (por tinción Gimsa)
Uso de tripsina en citogenética
La tripsina degrada proteínas y tiñe al cromosoma
Los colorantes son afines al DNA, se tiñen más si están más condensados
Citogenética: Bandas C
Las bandas C tiñen heterocromatina
Bandas R
Lo contrario a bandas G.
Se tiñe lo opuesto a lo que se tiñe en la banda G
FISH
Sonda complementaria con fluorescencia.
Se pintan los cromosomas de acuerdo con lo que se busca:
- Normal: 2 rojos, 2 verdes
- Traslocación robertsoniana en leucemia: se ven 1 rojo, 1 verde y 2 amarillos
Tinción en FISH
Puede ser pericentromérica o pancentromérica
En fluorescencia se tiñe DNA con azul “DAPi”
Cariotipo espectral
A cada cromosoma se le da un color. Si hay alteraciones se combinan los colores
CGH: arreglo citogenético
Se usa para deleciones y duplicaciones.
Si se va más hacia el lado del paciente es una duplicación, si se va más hacia el control es una deleción.
MLPA
Se utiliza para duplicaciones o deleciones. Ayuda a detectar mutaciones concretas
Tiene varios pasos:
1. Denaturalización
2. Hibridación (con MLPA probes y buffer)
3. Ligado (se añaden ligasas)
4. Amplificación con PCR
5. Separación de fragmentos dependiendo de su tamaño. Se mide con un electroferograma
6. Análisis de la información
