5.6 Le plasmide et le clonage bacterien

Question 1

les enzymes de restriction font quoi?

Answer 1

produisent des fragments d’ADN

Question 2

la base du clongae traditionnel

Answer 2

construction de l’ADN recombinant et son maintient dans des cellules: les enzymes
de restriction produisent des fragments d’ADN, la ligase soude ces fragments dans les
plasmides (vecteurs) et ces derniers sont insérés dans les bactéries.

Question 3

but des vecteurs de propagation?

Answer 3

amplification du fragment

Question 4

but des vecteurs d’expression?

Answer 4

présence d’un promoteur avec le but de produire une protéine

Question 5

cest quoi un vecteur?

Answer 5

Vecteur: qui peut transmettre quelque chose. En biologie moléculaire, c’est une molécule d’ADN circulaire susceptible de recevoir
un fragment d’ADN étranger pour ensuite le maintenir dans la cellule hôte; souvent basé sur les plasmides bactériens ou viraux

Question 6

forme de plasmide naturel

Answer 6

circulaire

Question 7

on retrouve plasmide naturel ou?

Answer 7

chez bacteries et archea

Question 8

comment est la replication d’un plasmide naturel?

Answer 8

autonome: pas besoin de repliquer genome pour repliquer plasmide

Question 9

plasmide naturel contient quoi?

Answer 9

des informations supplementaires au genome (info qui devient utile si conditions change)

Question 10

vrai ou faux? les plasmides utilises pour le clonage en labo ont ete modifies

Answer 10

vrai: Les plasmides utilisés pour le clonage en laboratoire ont été modifiés et ne
contiennent plus que les éléments minimums nécessaires au travail expérimental.

Question 11

qu’est ce qui se passe si plasmide n’as pas ORI?

Answer 11

si plasmide n’a pas ORI, seulement une des 2 cellules filles qui va recevoir et eventuellement ca va etre perdu: on a besoin d’ORI pour garder les plasmides dans une population bacterienne

Question 12

marqueur de selection sert a quoi?

Answer 12

lorsqu’on met plasmide dans bacterie, cest un processus pas super efficace, pour la plupart des bacteries, on va pas le reussir (on aura une population mixe: certains bacteries ont plasmide tandis que d’autres ont pas): on veut savoir lequel d’entre eux ont des plasmides: on utilise souvent avec resistance aux antibiotiques pour les selectionner

Question 13

site multiclonage permet quoi?

Answer 13

permet l’insertion de fragments de restriction

Question 14

cest quoi un site multiclonage?

Answer 14

site de multiclonage: site ou on a plusieurs sites de restrictions pour enzymes de restrictions differentes: cest ici quon va inserer sequence d’ADN sur lequel on veut travailler

Question 15

les ADN circulaires naturels ont cb d’ORI?

Answer 15

1 seule

Question 16

les ORI utilisee dans les vecteurs proviennent d’ou?

Answer 16

proviennent directement ou sont dérivées de plasmides naturels

Question 17

vrai ou faux? La séquence de l’origine de réplication aura une influence sur le nombre de
copies du vecteur produit par chaque cellule

Answer 17

vrai: Certains vecteurs sont limités à
quelques copies (faible rendement), d’autres peuvent atteindre 500-1000
copies / bactérie (haut rendement)

Question 18

Quels facteurs (2) sont importants dans
une séquence d’ORI? En d’autres
termes, pourquoi certaines séquences
donnent un faible rendement alors que
d’autres donnent un haut rendement?

Answer 18

le premier facteur important dans la séquence ORI est la complémentarité entre sa séquence et la protéine initiatrice. Puisque la protéine initiatrice reconnait une séquence spécifique, on peut imaginer que le fait de ne pas avoir exactement la même séquence réduirait la quantité de liens possibles entre eux et donc réduirait leur affinité, la réplication sera initiée moins souvent.

on doit pouvoir ouvrir le double-brin. Cette facilité à ouvrir le double-brin va surtout dépendre de la richesse de l’ORI en A/T. Il est avantageux pour une bactérie d’utiliser moins d’énergie pour ouvrir le double-brin, alors elle préfère une ouverture facile!

Question 19

les marqueurs de selection sont generalement quoi?

Answer 19

des gènes de résistance

à un antibiotique

Question 20

les marqueurs de selection permettent quoi?

Answer 20

d’isoler les
bactéries ayant incorporé les vecteurs

La transformation d’une bactérie (ajout d’un
plasmide) n’est pas efficace à 100%, mais si on
fait pousser les bactéries sur un milieu sélectif
(selon le marqueur) seulement les bactéries
ayant incorporé le vecteur pourront survivre

Question 21

vrai ou faux? le fragment de restriction qu’on veut insérer et le vecteur doivent
être coupés avec la même enzyme de restriction ou les enzymes différentes,
mais qui génèrent des coupures cohésives compatibles

Answer 21

vrai

Question 22

vecteurs de propagation permettent quoi?

Answer 22

de répliquer le vecteur en grande
quantité dans la bactérie; destinés à purifier et à amplifier un ADN particulier

utilise pour construire banques genomiques

Question 23

vecteurs d’expression permettent quoi?

Answer 23

Ils possèdent un promoteur actif, qui répond à la
régulation génique, généralement dérivée du génome de l’organisme hôte (celui
qui reçoit le plasmide). Production des protéines dans l’espèce d’intérêt

Question 24

vrai ou faux?si je mettais gene de promoteur de poisson dans tomate, il faudrait mettre promoteur de poisson

Answer 24

FAUX: si je mettais ce gene de promoteur de poisson dans tomate, il faudrait mettre promoteur de tomate

Question 25

on met quoi pour detecter proteine produite?

Answer 25

Des marqueurs fluorescents (GFP par exemple) ou détectables par
anticorps peuvent être ajoutés au gène selon le plasmide utilisé.

Question 26

etapes de la recombinaison

Answer 26

1. enzyme de restriction produisent fragments d’ADN
2. ligase soude les fragments d’ADN (gene interet) avec le plasmide. On parle alors d’ADN recombinant. Une portion des plasmides se refermeront sur eux-memes
3. les bacteries qui ont incorpore le plasmide avec l’insert vont pouvoir etre selectrionnees sur un petri adequat

Question 27

cest quoi la transformation?

Answer 27

La transformation est un processus par lequel
les organismes récupèrent un ADN présent dans leur milieu extracellulaire.
Certaines bactéries ont cette capacité naturelle qu’on appelle la compétence
génétique, mais d’autre comme E. coli, ne l’ont pas. Il faut alors rendre nos
bactéries compétentes

Question 28

quels sont les techniques utilise pour rendre bacteries competente?

Answer 28

choc thermique et

l’électroporation

Question 29

cest quoi la competence genetique?

Answer 29

Certaines bactéries ont cette capacité naturelle de recuperer un ADN present dans leur milieu extracellulaire

Les bactéries rendues compétentes vont incorporer plus
ou moins un vecteur (le taux de transformation est très bas).

Question 30

etapes pour rendre bacteries competent en utilisant l’electroporation (meme pour choc thermique sauf qu’on fait choc thermique au lieu de choc electrique)

Answer 30

1. faire croite bacteries en grande qte
2. electrophoration: on va prendre bacteries de leur milieu de culture, on va les centrifugier et on va les nettoyer plusieurs fois: l’idee ici c’est d’enlever tout ce qui peut empecher ou interferer lorsquon applique courant electrique: donc on nettoie avec eau sterile sans ions de preference
3. 3- on applique choc electrique: cela va polariser tous les ions presents: les charges se regroupent ensemble: les proteines membranaires vont changer de configuration selon la compatiblite avec charges presentes: je suis en train de faire des pores: pendant ce moment la, les plasmides ont une chance d’entrer:pas tres efficace: il y a bcp de chance de tuer la cellule

Question 31

comment la chaleur aide a rendre les bacteries competentes?

Answer 31

la chaleur cause:

• Différence de pression entre le milieu extracellulaire et intracellulaire
• Augmentation fluidité membrane -la chaleur déstabilise les liens entre les phospholipides
• La membrane bactérienne possède également des protéines. La chaleur va dénaturer c’est protéine en rompant les liaisons faibles comme les pont H. La protéine va ainsi perdre sa conformation tridimensionnelle et devient donc inactive. De plus, la protéine contenait des zones hydrophobes pour se retrouver dans la membrane, alors en dépliant la protéine cela peut conduire à l’agrégation de celle-ci par effet hydrophobe

Question 32

etapes de la premiere selection

Answer 32

Les bactéries ayant incorporé les
vecteurs ont maintenant le gène de
résistance présent sur le plasmide (ex.
ampR) qui leur permettra de survivre au
milieu sélectif (+ampicilline). Mais, elles
peuvent avoir soit un vecteur
recombinant ou non recombinant

Les bactéries ayant incorporé un vecteur
vont croître sur le milieu avec antibiotique,
mais seules celles ayant un vecteur
recombinant seront blanches.

Question 33

etapes de la deuxieme selection

Answer 33

Le site d’insertion (MCS) est situé à
l’intérieur du gène lacZ. Si l’insertion a
lieu, ce dernier ne sera plus transcrit. En
ajoutant sont substrat au milieu (+ x-gal),
il est alors possible de voire si ce gène est
exprimé ou non (x-gal hydrolysé par LacZ
= couleur bleue).

Le vecteur recombinant avec
l’insert au centre du gène lacZ
le rend non-fonctionnel et les
colonies sont blanches.

Question 34

utilisation de plasmides recombines et de souches bacteriennes adequates permettent quoi?

Answer 34

la transfection d’un organisme complexe

Question 35

vrai ou faux? les cellules eucaryotes peuvent garder l’ADN recombinant sous forme de plasmide

Answer 35

FAUX: Les cellules eucaryotes ne pourront pas garder l’ADN recombinant
sous forme de plasmide, elles intègrent cet ADN dans leur génome

Question 36

cest quoi incorporation extopique?

Answer 36

Une portion délimitée du
plasmide s’intégrera au hasard
dans le génome de la cellule.
Peut se retrouver dans l’ADN
intergénique ou dans un gène…
Généralement utilisé pour un
gène étranger.

Question 37

cest quoi remplacement d’un gene?

Answer 37

L’ADN recombinant est entouré
de séquences précises qui
permettront l’échange d’une
région du génome pour l’ADN
recombinant (recombinaison
homologue).
Utilisé pour introduire une
version mutée du gène.