5.6 Le plasmide et le clonage bacterien Flashcards
les enzymes de restriction font quoi?
produisent des fragments d’ADN
la base du clongae traditionnel
construction de l’ADN recombinant et son maintient dans des cellules: les enzymes
de restriction produisent des fragments d’ADN, la ligase soude ces fragments dans les
plasmides (vecteurs) et ces derniers sont insérés dans les bactéries.
but des vecteurs de propagation?
amplification du fragment
but des vecteurs d’expression?
présence d’un promoteur avec le but de produire une protéine
cest quoi un vecteur?
Vecteur: qui peut transmettre quelque chose. En biologie moléculaire, c’est une molécule d’ADN circulaire susceptible de recevoir
un fragment d’ADN étranger pour ensuite le maintenir dans la cellule hôte; souvent basé sur les plasmides bactériens ou viraux
forme de plasmide naturel
circulaire
on retrouve plasmide naturel ou?
chez bacteries et archea
comment est la replication d’un plasmide naturel?
autonome: pas besoin de repliquer genome pour repliquer plasmide
plasmide naturel contient quoi?
des informations supplementaires au genome (info qui devient utile si conditions change)
vrai ou faux? les plasmides utilises pour le clonage en labo ont ete modifies
vrai: Les plasmides utilisés pour le clonage en laboratoire ont été modifiés et ne
contiennent plus que les éléments minimums nécessaires au travail expérimental.
qu’est ce qui se passe si plasmide n’as pas ORI?
si plasmide n’a pas ORI, seulement une des 2 cellules filles qui va recevoir et eventuellement ca va etre perdu: on a besoin d’ORI pour garder les plasmides dans une population bacterienne
marqueur de selection sert a quoi?
lorsqu’on met plasmide dans bacterie, cest un processus pas super efficace, pour la plupart des bacteries, on va pas le reussir (on aura une population mixe: certains bacteries ont plasmide tandis que d’autres ont pas): on veut savoir lequel d’entre eux ont des plasmides: on utilise souvent avec resistance aux antibiotiques pour les selectionner
site multiclonage permet quoi?
permet l’insertion de fragments de restriction
cest quoi un site multiclonage?
site de multiclonage: site ou on a plusieurs sites de restrictions pour enzymes de restrictions differentes: cest ici quon va inserer sequence d’ADN sur lequel on veut travailler
les ADN circulaires naturels ont cb d’ORI?
1 seule
les ORI utilisee dans les vecteurs proviennent d’ou?
proviennent directement ou sont dérivées de plasmides naturels
vrai ou faux? La séquence de l’origine de réplication aura une influence sur le nombre de
copies du vecteur produit par chaque cellule
vrai: Certains vecteurs sont limités à
quelques copies (faible rendement), d’autres peuvent atteindre 500-1000
copies / bactérie (haut rendement)
Quels facteurs (2) sont importants dans une séquence d’ORI? En d’autres termes, pourquoi certaines séquences donnent un faible rendement alors que d’autres donnent un haut rendement?
le premier facteur important dans la séquence ORI est la complémentarité entre sa séquence et la protéine initiatrice. Puisque la protéine initiatrice reconnait une séquence spécifique, on peut imaginer que le fait de ne pas avoir exactement la même séquence réduirait la quantité de liens possibles entre eux et donc réduirait leur affinité, la réplication sera initiée moins souvent.
on doit pouvoir ouvrir le double-brin. Cette facilité à ouvrir le double-brin va surtout dépendre de la richesse de l’ORI en A/T. Il est avantageux pour une bactérie d’utiliser moins d’énergie pour ouvrir le double-brin, alors elle préfère une ouverture facile!
les marqueurs de selection sont generalement quoi?
des gènes de résistance
à un antibiotique
les marqueurs de selection permettent quoi?
d’isoler les
bactéries ayant incorporé les vecteurs
La transformation d’une bactérie (ajout d’un
plasmide) n’est pas efficace à 100%, mais si on
fait pousser les bactéries sur un milieu sélectif
(selon le marqueur) seulement les bactéries
ayant incorporé le vecteur pourront survivre
vrai ou faux? le fragment de restriction qu’on veut insérer et le vecteur doivent
être coupés avec la même enzyme de restriction ou les enzymes différentes,
mais qui génèrent des coupures cohésives compatibles
vrai
vecteurs de propagation permettent quoi?
de répliquer le vecteur en grande
quantité dans la bactérie; destinés à purifier et à amplifier un ADN particulier
utilise pour construire banques genomiques
vecteurs d’expression permettent quoi?
Ils possèdent un promoteur actif, qui répond à la
régulation génique, généralement dérivée du génome de l’organisme hôte (celui
qui reçoit le plasmide). Production des protéines dans l’espèce d’intérêt
vrai ou faux?si je mettais gene de promoteur de poisson dans tomate, il faudrait mettre promoteur de poisson
FAUX: si je mettais ce gene de promoteur de poisson dans tomate, il faudrait mettre promoteur de tomate