5.6 Le plasmide et le clonage bacterien Flashcards
les enzymes de restriction font quoi?
produisent des fragments d’ADN
la base du clongae traditionnel
construction de l’ADN recombinant et son maintient dans des cellules: les enzymes
de restriction produisent des fragments d’ADN, la ligase soude ces fragments dans les
plasmides (vecteurs) et ces derniers sont insérés dans les bactéries.
but des vecteurs de propagation?
amplification du fragment
but des vecteurs d’expression?
présence d’un promoteur avec le but de produire une protéine
cest quoi un vecteur?
Vecteur: qui peut transmettre quelque chose. En biologie moléculaire, c’est une molécule d’ADN circulaire susceptible de recevoir
un fragment d’ADN étranger pour ensuite le maintenir dans la cellule hôte; souvent basé sur les plasmides bactériens ou viraux
forme de plasmide naturel
circulaire
on retrouve plasmide naturel ou?
chez bacteries et archea
comment est la replication d’un plasmide naturel?
autonome: pas besoin de repliquer genome pour repliquer plasmide
plasmide naturel contient quoi?
des informations supplementaires au genome (info qui devient utile si conditions change)
vrai ou faux? les plasmides utilises pour le clonage en labo ont ete modifies
vrai: Les plasmides utilisés pour le clonage en laboratoire ont été modifiés et ne
contiennent plus que les éléments minimums nécessaires au travail expérimental.
qu’est ce qui se passe si plasmide n’as pas ORI?
si plasmide n’a pas ORI, seulement une des 2 cellules filles qui va recevoir et eventuellement ca va etre perdu: on a besoin d’ORI pour garder les plasmides dans une population bacterienne
marqueur de selection sert a quoi?
lorsqu’on met plasmide dans bacterie, cest un processus pas super efficace, pour la plupart des bacteries, on va pas le reussir (on aura une population mixe: certains bacteries ont plasmide tandis que d’autres ont pas): on veut savoir lequel d’entre eux ont des plasmides: on utilise souvent avec resistance aux antibiotiques pour les selectionner
site multiclonage permet quoi?
permet l’insertion de fragments de restriction
cest quoi un site multiclonage?
site de multiclonage: site ou on a plusieurs sites de restrictions pour enzymes de restrictions differentes: cest ici quon va inserer sequence d’ADN sur lequel on veut travailler
les ADN circulaires naturels ont cb d’ORI?
1 seule
les ORI utilisee dans les vecteurs proviennent d’ou?
proviennent directement ou sont dérivées de plasmides naturels
vrai ou faux? La séquence de l’origine de réplication aura une influence sur le nombre de
copies du vecteur produit par chaque cellule
vrai: Certains vecteurs sont limités à
quelques copies (faible rendement), d’autres peuvent atteindre 500-1000
copies / bactérie (haut rendement)
Quels facteurs (2) sont importants dans une séquence d’ORI? En d’autres termes, pourquoi certaines séquences donnent un faible rendement alors que d’autres donnent un haut rendement?
le premier facteur important dans la séquence ORI est la complémentarité entre sa séquence et la protéine initiatrice. Puisque la protéine initiatrice reconnait une séquence spécifique, on peut imaginer que le fait de ne pas avoir exactement la même séquence réduirait la quantité de liens possibles entre eux et donc réduirait leur affinité, la réplication sera initiée moins souvent.
on doit pouvoir ouvrir le double-brin. Cette facilité à ouvrir le double-brin va surtout dépendre de la richesse de l’ORI en A/T. Il est avantageux pour une bactérie d’utiliser moins d’énergie pour ouvrir le double-brin, alors elle préfère une ouverture facile!
les marqueurs de selection sont generalement quoi?
des gènes de résistance
à un antibiotique
les marqueurs de selection permettent quoi?
d’isoler les
bactéries ayant incorporé les vecteurs
La transformation d’une bactérie (ajout d’un
plasmide) n’est pas efficace à 100%, mais si on
fait pousser les bactéries sur un milieu sélectif
(selon le marqueur) seulement les bactéries
ayant incorporé le vecteur pourront survivre
vrai ou faux? le fragment de restriction qu’on veut insérer et le vecteur doivent
être coupés avec la même enzyme de restriction ou les enzymes différentes,
mais qui génèrent des coupures cohésives compatibles
vrai
vecteurs de propagation permettent quoi?
de répliquer le vecteur en grande
quantité dans la bactérie; destinés à purifier et à amplifier un ADN particulier
utilise pour construire banques genomiques
vecteurs d’expression permettent quoi?
Ils possèdent un promoteur actif, qui répond à la
régulation génique, généralement dérivée du génome de l’organisme hôte (celui
qui reçoit le plasmide). Production des protéines dans l’espèce d’intérêt
vrai ou faux?si je mettais gene de promoteur de poisson dans tomate, il faudrait mettre promoteur de poisson
FAUX: si je mettais ce gene de promoteur de poisson dans tomate, il faudrait mettre promoteur de tomate
on met quoi pour detecter proteine produite?
Des marqueurs fluorescents (GFP par exemple) ou détectables par
anticorps peuvent être ajoutés au gène selon le plasmide utilisé.
etapes de la recombinaison
- enzyme de restriction produisent fragments d’ADN
- ligase soude les fragments d’ADN (gene interet) avec le plasmide. On parle alors d’ADN recombinant. Une portion des plasmides se refermeront sur eux-memes
- les bacteries qui ont incorpore le plasmide avec l’insert vont pouvoir etre selectrionnees sur un petri adequat
cest quoi la transformation?
La transformation est un processus par lequel
les organismes récupèrent un ADN présent dans leur milieu extracellulaire.
Certaines bactéries ont cette capacité naturelle qu’on appelle la compétence
génétique, mais d’autre comme E. coli, ne l’ont pas. Il faut alors rendre nos
bactéries compétentes
quels sont les techniques utilise pour rendre bacteries competente?
choc thermique et
l’électroporation
cest quoi la competence genetique?
Certaines bactéries ont cette capacité naturelle de recuperer un ADN present dans leur milieu extracellulaire
Les bactéries rendues compétentes vont incorporer plus
ou moins un vecteur (le taux de transformation est très bas).
etapes pour rendre bacteries competent en utilisant l’electroporation (meme pour choc thermique sauf qu’on fait choc thermique au lieu de choc electrique)
- faire croite bacteries en grande qte
- electrophoration: on va prendre bacteries de leur milieu de culture, on va les centrifugier et on va les nettoyer plusieurs fois: l’idee ici c’est d’enlever tout ce qui peut empecher ou interferer lorsquon applique courant electrique: donc on nettoie avec eau sterile sans ions de preference
- 3- on applique choc electrique: cela va polariser tous les ions presents: les charges se regroupent ensemble: les proteines membranaires vont changer de configuration selon la compatiblite avec charges presentes: je suis en train de faire des pores: pendant ce moment la, les plasmides ont une chance d’entrer:pas tres efficace: il y a bcp de chance de tuer la cellule
comment la chaleur aide a rendre les bacteries competentes?
la chaleur cause:
- Différence de pression entre le milieu extracellulaire et intracellulaire
- Augmentation fluidité membrane -la chaleur déstabilise les liens entre les phospholipides
- La membrane bactérienne possède également des protéines. La chaleur va dénaturer c’est protéine en rompant les liaisons faibles comme les pont H. La protéine va ainsi perdre sa conformation tridimensionnelle et devient donc inactive. De plus, la protéine contenait des zones hydrophobes pour se retrouver dans la membrane, alors en dépliant la protéine cela peut conduire à l’agrégation de celle-ci par effet hydrophobe
etapes de la premiere selection
Les bactéries ayant incorporé les vecteurs ont maintenant le gène de résistance présent sur le plasmide (ex. ampR) qui leur permettra de survivre au milieu sélectif (+ampicilline). Mais, elles peuvent avoir soit un vecteur recombinant ou non recombinant
Les bactéries ayant incorporé un vecteur
vont croître sur le milieu avec antibiotique,
mais seules celles ayant un vecteur
recombinant seront blanches.
etapes de la deuxieme selection
Le site d’insertion (MCS) est situé à
l’intérieur du gène lacZ. Si l’insertion a
lieu, ce dernier ne sera plus transcrit. En
ajoutant sont substrat au milieu (+ x-gal),
il est alors possible de voire si ce gène est
exprimé ou non (x-gal hydrolysé par LacZ
= couleur bleue).
Le vecteur recombinant avec
l’insert au centre du gène lacZ
le rend non-fonctionnel et les
colonies sont blanches.
utilisation de plasmides recombines et de souches bacteriennes adequates permettent quoi?
la transfection d’un organisme complexe
vrai ou faux? les cellules eucaryotes peuvent garder l’ADN recombinant sous forme de plasmide
FAUX: Les cellules eucaryotes ne pourront pas garder l’ADN recombinant
sous forme de plasmide, elles intègrent cet ADN dans leur génome
cest quoi incorporation extopique?
Une portion délimitée du plasmide s’intégrera au hasard dans le génome de la cellule. Peut se retrouver dans l’ADN intergénique ou dans un gène… Généralement utilisé pour un gène étranger.
cest quoi remplacement d’un gene?
L’ADN recombinant est entouré de séquences précises qui permettront l’échange d’une région du génome pour l’ADN recombinant (recombinaison homologue). Utilisé pour introduire une version mutée du gène.
