3.4-Animaux transgéniques

Question 1

Comment on peut manipuler le génome de la souris(technique utilisée)

Answer 1

avec une injection d’ADN dans le pronucleus mâle d’un oeuf fécondé

Question 2

c’est quoi le KO chez la souris

Answer 2

une inactivation/délétion d’un gène d’un animal par recombinaison homologue

Question 3

c’est quoi le knock-in

Answer 3

le remplacement du gène de souris par un gène humain

Question 4

combien de copies de gènes sont ajoutées par knock-in

Answer 4

2 pour augmenter les niveaux d’une protéine

Question 5

5 techniques de transgénèse chez les animaux

Answer 5

1) par rétrovirus
2) micro-injection de pronucléus
3) cellule souche embryonnaire
4) transfert médié par le spermatozoide
5) Gene gun

Question 6

c’est quoi les étapes de la méthode de la microinjection

Answer 6

1) incubation des femelles en superovulation (après traitement avec hCG) avec les mâles
2) récupération des zygotes le lendemain (doivent contenir 2 pronucléus)
3) injection dans cytoplasme/pronucléus+cytosplasme/pronucléus avec système de micro-injection
4) transfert d’embryos

Question 7

quel composé peut être transmis par la méthode de microinjection

Answer 7

ADN, ARN ou protéine

Question 8

Comment les embryos sont récupérés et isolés pour la microinjection (3 étapes)

Answer 8

1) déchirer l’ampoule pour retirer les zygotes
2) outer hyalurinodase pour digerer la masse de cumulus
3) laver et sélectionner zygotes

Question 9

c’est quoi une alternative à la microinjection pour les zygotes

Answer 9

l’électroporation des zygotes pour la transfection des nucléases (CRISPR-Cas9)

Question 10

comment on effectue le transfert de zygotes pour la microinjection

Answer 10

la femelle receveuse est accouplé avec le mâle infertile et 25-40 zygotes sont transférés à la femelle

Question 11

4 limites du transfert des embryons/zygotes (technique de microinjection)

Answer 11

1) mutations du gène peuvent interferer avec développement normal de l’embryon/viabilité
2) ADN injecté peut s’integrer à différents sites dans le génome (pas précis)
3) plusieurs copies d’ADN peuvent être incorporées
4) seulement 5% des zygotes injectés mènent à une progéniture transgénique

Question 12

comment utiliser le rétrovirus pour développer des souris transgéniques

Answer 12

1) on infecte l’embryon au stade précoce (moins que 8 semaines) avec un rétrovirus qui contient le gène cible
2) transfert l’embryin dans une femelle réceptrice

Question 13

1 avantage et 1 inconvénient pour la méthode du rétrovirus pour développer une souris transgénique

Answer 13

A=plus de 80% des progénitures sont transgéniques
I=intégration génomique aléatoire (pas précis)

Question 14

5 étapes pour la méthode de développememnt de souris transgéniques à l’aide de cellules souches d’embryon

Answer 14

1) isoler cellules osuches embryonnaires
2) transfecter les cellules avec transgène
3) cellules ayant recu le transgène sont identifiées par PCR
4) enrichissemment pour les cellules avec transgène
5) cellules sont microinjectées dans les blastocytes des souris réceptrices

Question 15

comment les cellules souches transféctées seront enrichies

Answer 15

par sélection positive-négative

Question 16

c’est quoi la sélection positive-négative pour les cellules souches transformées

Answer 16

integration du transgène par recombinaison homologue par HB1 et HB2
1) 1ère sélection pour les inteégrations non-spécifiques: gancuclovir pour les cellules avec Tk1
2) 2 ème sélection pour les intégrations spécifiques: résistance face au ganciclovir et G-418 (Neor)

Question 17

comment le système de Cre-lox fonctionne

Answer 17

la cre recombinase reconnais et coupe+recombine l’ADN des sites loxP. elle peut soit exciser l’ADN entre les sites ou inverser le gène entre les 2 sites dépendemment de leur orientation

Question 18

à quel moment Cre va inverser la région cible

Answer 18

quand les 2 sites loxP sont à différentes orientations

Question 19

à quel moment Cre va exciser la région cible

Answer 19

quand les 2 sites loxP sont dans la même orientation

Question 20

comment utiliser le système cre-lox

Answer 20

1) prendre souris transgénique porteuse du gène Cre et croiser avec souris transgénique porteuse de 2 sites loxP
2) gène inactif chez souris qui expriment enzyme Cre +2 sites loxP

Question 21

comment le gène Cre peut être activé à un stade spécifique du développement

Answer 21

en utilisant un agent (tamoxifène) pour activer l’enzyme Cre

Question 22

4 applications spécifiques pour le système Cre-lox

Answer 22

1) délétion du gène (loxP même orientation)
2) inversion (loxP direction opposée)
3) knockout conditionnel
4) expression conditionnelle

Question 23

Comment Cre-lox peut causer un KO conditionnel

Answer 23

la souris pour le KO conditionnel porte un exon flanqué de loxP pour un gène cible. quand la souris est croisé avec une souris Cre+, l’exon flanqué est supprimé du génome ce qui entraine l’arrêt prématuré de la traduction en raison de la mutation de type Framshift

Question 24

Comment Cre-lox peut causer une expression conditionnelle

Answer 24

la souris pour l’expression conditionnelle exprime une séquence STOP entre les 2 sites loxP. Lors de son croissement avec une souris Cre+, la séquence STOP est excisée et l’ADN est transcrit

Question 25

c’est quoi le Cre-LoxP flex switch

Answer 25

c’est lorsqu’on ajoute une deuxième paire de sites LoxP pour avoir:
-expression conditionnelle d’un gène
-inactivation conditionnelle d’un gène
-permet élimination d’un des membres de la paire précédente

Question 26

6 étapes de la production des souris transgéniques porteuses des sites loxP/gène Cre

Answer 26

1) cellules souches embryonnaires prélévées d’un embryon donneur
2) sites loxP/Cre inséré dans génome par recombinaison homologue (CRISPR-Cas9)
3) cellules souches modifiées sont injectées dans un embryon receveur
4) embryon injecté dans l’utérus de la mère porteuse
5) naissance de la souris chimérique
6) croissements pour obtenir une souris homozygote transgénique

Question 27

comment utiliser l’ARN d’interférence pour créer les animaux transgéniques (Knock down)

Answer 27

développer des souris qui surexpriment un gène codant pour les shARN qui vont ensuite maturer en siARN pour inhiber/dégrader l’ARNm d’une protéine cible.

Avec la dégradation de l’ARNm dsGFP/target comme contrôle

Question 28

Quelle méthode peut remplacer la microinjection pour produire animaux transgéniques

Answer 28

remplacé par le transfert de noyaux à partir de cellules somatiques transgéniques dans un oocyte récepteur

Question 29

8 étapes du transfert de noyaux à partir de cellules somatiques transgéniques dans un oocyte récepteur

Answer 29

1) collecte des oocytes
2) maturation in vitro
3) fécondation in vitro
4) centrifugation des oeufs
5) microinjection d’ADN dans le pronucléus mâle
6) développement embryonnaire jusqu’à blastocyste
7) implantation de l’embryon
8) dépistage des petits pour la transgénèse

Question 30

utilités des animaux transgéniques

Answer 30

1) augmentation de la production agricole
2) xénotransplantation
3) animaux transgéniques comme bioréacteurs
4) production de produits pharmaceutiques
5) animaux transgéniques résistants aux maladies