3.4-Animaux transgéniques Flashcards
Comment on peut manipuler le génome de la souris(technique utilisée)
avec une injection d’ADN dans le pronucleus mâle d’un oeuf fécondé
c’est quoi le KO chez la souris
une inactivation/délétion d’un gène d’un animal par recombinaison homologue
c’est quoi le knock-in
le remplacement du gène de souris par un gène humain
combien de copies de gènes sont ajoutées par knock-in
2 pour augmenter les niveaux d’une protéine
5 techniques de transgénèse chez les animaux
1) par rétrovirus
2) micro-injection de pronucléus
3) cellule souche embryonnaire
4) transfert médié par le spermatozoide
5) Gene gun
c’est quoi les étapes de la méthode de la microinjection
1) incubation des femelles en superovulation (après traitement avec hCG) avec les mâles
2) récupération des zygotes le lendemain (doivent contenir 2 pronucléus)
3) injection dans cytoplasme/pronucléus+cytosplasme/pronucléus avec système de micro-injection
4) transfert d’embryos
quel composé peut être transmis par la méthode de microinjection
ADN, ARN ou protéine
Comment les embryos sont récupérés et isolés pour la microinjection (3 étapes)
1) déchirer l’ampoule pour retirer les zygotes
2) outer hyalurinodase pour digerer la masse de cumulus
3) laver et sélectionner zygotes
c’est quoi une alternative à la microinjection pour les zygotes
l’électroporation des zygotes pour la transfection des nucléases (CRISPR-Cas9)
comment on effectue le transfert de zygotes pour la microinjection
la femelle receveuse est accouplé avec le mâle infertile et 25-40 zygotes sont transférés à la femelle
4 limites du transfert des embryons/zygotes (technique de microinjection)
1) mutations du gène peuvent interferer avec développement normal de l’embryon/viabilité
2) ADN injecté peut s’integrer à différents sites dans le génome (pas précis)
3) plusieurs copies d’ADN peuvent être incorporées
4) seulement 5% des zygotes injectés mènent à une progéniture transgénique
comment utiliser le rétrovirus pour développer des souris transgéniques
1) on infecte l’embryon au stade précoce (moins que 8 semaines) avec un rétrovirus qui contient le gène cible
2) transfert l’embryin dans une femelle réceptrice
1 avantage et 1 inconvénient pour la méthode du rétrovirus pour développer une souris transgénique
A=plus de 80% des progénitures sont transgéniques
I=intégration génomique aléatoire (pas précis)
5 étapes pour la méthode de développememnt de souris transgéniques à l’aide de cellules souches d’embryon
1) isoler cellules osuches embryonnaires
2) transfecter les cellules avec transgène
3) cellules ayant recu le transgène sont identifiées par PCR
4) enrichissemment pour les cellules avec transgène
5) cellules sont microinjectées dans les blastocytes des souris réceptrices
comment les cellules souches transféctées seront enrichies
par sélection positive-négative
c’est quoi la sélection positive-négative pour les cellules souches transformées
integration du transgène par recombinaison homologue par HB1 et HB2
1) 1ère sélection pour les inteégrations non-spécifiques: gancuclovir pour les cellules avec Tk1
2) 2 ème sélection pour les intégrations spécifiques: résistance face au ganciclovir et G-418 (Neor)
comment le système de Cre-lox fonctionne
la cre recombinase reconnais et coupe+recombine l’ADN des sites loxP. elle peut soit exciser l’ADN entre les sites ou inverser le gène entre les 2 sites dépendemment de leur orientation
à quel moment Cre va inverser la région cible
quand les 2 sites loxP sont à différentes orientations
à quel moment Cre va exciser la région cible
quand les 2 sites loxP sont dans la même orientation
comment utiliser le système cre-lox
1) prendre souris transgénique porteuse du gène Cre et croiser avec souris transgénique porteuse de 2 sites loxP
2) gène inactif chez souris qui expriment enzyme Cre +2 sites loxP
comment le gène Cre peut être activé à un stade spécifique du développement
en utilisant un agent (tamoxifène) pour activer l’enzyme Cre
4 applications spécifiques pour le système Cre-lox
1) délétion du gène (loxP même orientation)
2) inversion (loxP direction opposée)
3) knockout conditionnel
4) expression conditionnelle
Comment Cre-lox peut causer un KO conditionnel
la souris pour le KO conditionnel porte un exon flanqué de loxP pour un gène cible. quand la souris est croisé avec une souris Cre+, l’exon flanqué est supprimé du génome ce qui entraine l’arrêt prématuré de la traduction en raison de la mutation de type Framshift
Comment Cre-lox peut causer une expression conditionnelle
la souris pour l’expression conditionnelle exprime une séquence STOP entre les 2 sites loxP. Lors de son croissement avec une souris Cre+, la séquence STOP est excisée et l’ADN est transcrit
c’est quoi le Cre-LoxP flex switch
c’est lorsqu’on ajoute une deuxième paire de sites LoxP pour avoir:
-expression conditionnelle d’un gène
-inactivation conditionnelle d’un gène
-permet élimination d’un des membres de la paire précédente
6 étapes de la production des souris transgéniques porteuses des sites loxP/gène Cre
1) cellules souches embryonnaires prélévées d’un embryon donneur
2) sites loxP/Cre inséré dans génome par recombinaison homologue (CRISPR-Cas9)
3) cellules souches modifiées sont injectées dans un embryon receveur
4) embryon injecté dans l’utérus de la mère porteuse
5) naissance de la souris chimérique
6) croissements pour obtenir une souris homozygote transgénique
comment utiliser l’ARN d’interférence pour créer les animaux transgéniques (Knock down)
développer des souris qui surexpriment un gène codant pour les shARN qui vont ensuite maturer en siARN pour inhiber/dégrader l’ARNm d’une protéine cible.
Avec la dégradation de l’ARNm dsGFP/target comme contrôle
Quelle méthode peut remplacer la microinjection pour produire animaux transgéniques
remplacé par le transfert de noyaux à partir de cellules somatiques transgéniques dans un oocyte récepteur
8 étapes du transfert de noyaux à partir de cellules somatiques transgéniques dans un oocyte récepteur
1) collecte des oocytes
2) maturation in vitro
3) fécondation in vitro
4) centrifugation des oeufs
5) microinjection d’ADN dans le pronucléus mâle
6) développement embryonnaire jusqu’à blastocyste
7) implantation de l’embryon
8) dépistage des petits pour la transgénèse
utilités des animaux transgéniques
1) augmentation de la production agricole
2) xénotransplantation
3) animaux transgéniques comme bioréacteurs
4) production de produits pharmaceutiques
5) animaux transgéniques résistants aux maladies
