1.2-clonage moléculaire et vecteurs Flashcards
c’est quoi les 5 étapes du clonage
1) préparation du vecteur
2) préparation de l’insert
3) ligation de l’insesrt au vecteur
4) transformation des bactéries
5) criblage des colonies (sélection)
c’est quoi le clonage moléculaire
obtenir un morceau d’ADN à partir du génome et l’inserer dans un vecteur d’ADN
c’est quoi un plasmide
vecteur d’information génétique chez les bactéries
c’est quoi les enzymes de restriction de type II
endonucléases qui reconnaissent une séquence spécifique (souvent palindrome) et coupent à un endroit spécifique
c’est quoi le nomenclature des enzymes de restriction (que signifient les lettres)
1ere lettre=genre
2e et 3e lettre=espèce
4e lettre=souche
5e lettre/chiffre=# d’ordre de caractérisation de l’enzyme
c’est quoi les 4 enzymes qui peuvent être utilisées pour modifier les sticky/blunt ends
1) mung bean nuclease
2) klenow polymérase
3) calf alkiline phosphatase
4) T4 polynucléotide kinase
rôle de la mung bean nucléase
enlève le sticky end pour former des blunt
ends
rôle de la klenow polymérase
ajoute des nucléotides aux bouts francs pour créer des sticky ends
rôle de la calf alkaline phosphatase
dephosphoryle l’ADN
rôle de la T4 polynucléotide kinase
phosphoryle l’ADN en présence d’ATP
différence entre enzymes de restriction compatibles et non compatibles
compatibles= après le clivage par l’enzyme, les sticky ends sont complémentaires et lient à un l’autre
non compatibles=il faut modifier la séquence d’ADN avec autres enzymes pour rendre les bouts complémentaires
3 façons de préparer un insert pour le clonage
1) par digestion avec enzymes de restriction
2) par PCR
3) par synthèse chimique
comment on prépare l’insert pour un clonage par PCR
on ajouter des sites de restriction aux amorces PCR qui seront amplifiés grâce au PCR
3 étapes du PCR
1) dénaturation du DB
2) hybridation des amorces sur l’ADN
3) élongation par PCR
comment la ligation de l’insert et du vecteur se fait
à l’aide d’une ligase (comme T4 ADN ligase par exemple) en présence de Mg2+ et ATP pour créer une liaison phosphodiester
c’est quoi la transformation des bactéries
intégration (naturelle ou intentionnelle) d’un fragement d’ADN étranger dans une cellule
2 façons de rendre les bactéries prêtes pour recevoir le plasmide (transformation)
1) par choc thermique (traitées au CaCl2)
2) par électroporation
2 types de criblages possibles pour la sélection des colonies
1) avoir un gène de résistance à l’antibiotique
2) sélection bleu/blanc avec LacZ et X-gal
comment fonctionne la sélection blue/blanc avec Xgal et LacZ
l’insert est integré dans le MCS qui se trouve dans le gène de lacZ.
Donc colonies avec plasmide sont blancs car pas de fonctionnement de LacZ et colonies sans plasmide sont bleues car LacZ fonctionnel et change Xgal en bleu
c’est quoi le séquencage sanger
séquencage de l’ADN à l’aide des ddNTPs qui n’ont pas un OH 3’ libre et donc arrêtent la polymérisation
3 étapes majeurs du séquencage sanger
1) réaction de PCR
2) produits de PCR
3) migration sur capillaire/électrophorèse
5 composantes importantes pour la réaction de PCR pour le séquencage sanger
1) ADN matrice
2) amorces
3) ddNTP
4)dNTP
5)polymérase
5 limites du clonage moléculaire classique
-disponibilité des sites de restiction
-compatibilité des sites de restriction
-orientation de l’insert
-inserts contaminants
-chronophage
c’est quoi les 3 méthodes de clonages altérnatives
1) clonage TOPO
2) clonage Gateway
3) gibson assembly
c’est quoi le clonage TOPO
clonage qui utilise la topoisomérase I pour liger l’insert et le vecteur en créant des liaisons covalentes
3 avantages d’utiliser le clonage TOPO
rapide, facile, clonage directionnel
c’est quoi le clonage gateway
clonage basé sur la recombinaison homologue entre 2 séquences spécifiques appelées AttB et AttP qui permet le transfert d’un vecteur à l’autre
2 avantages pour le clonage gateway
1) permet un transfert directionnel de l’insert entre différents vecteurs
2) utilisé pour applications protéomiques
c’est quoi le gibson assembly
technique qui permet l’assemblage de multiples séquences (besoin de overlap de 20-40 nucléotides entre les séquences)
3 composantes requises pour le gibson assembly
1) ADN ligase
2) ADN polymérase
3)exonucléase (3’->5’)
4 étapes du gibson assembly
1) exonucléase digère les extremités 5’
2) les 2 overhangs sont complémentaires et s’alignent
3) ADN poly rallonge les extremités 3’
4) ADN ligase lie les extremités pour completer le DB
