1.2-clonage moléculaire et vecteurs

Question 1

c’est quoi les 5 étapes du clonage

Answer 1

1) préparation du vecteur
2) préparation de l’insert
3) ligation de l’insesrt au vecteur
4) transformation des bactéries
5) criblage des colonies (sélection)

Question 2

c’est quoi le clonage moléculaire

Answer 2

obtenir un morceau d’ADN à partir du génome et l’inserer dans un vecteur d’ADN

Question 3

c’est quoi un plasmide

Answer 3

vecteur d’information génétique chez les bactéries

Question 4

c’est quoi les enzymes de restriction de type II

Answer 4

endonucléases qui reconnaissent une séquence spécifique (souvent palindrome) et coupent à un endroit spécifique

Question 5

c’est quoi le nomenclature des enzymes de restriction (que signifient les lettres)

Answer 5

1ere lettre=genre
2e et 3e lettre=espèce
4e lettre=souche
5e lettre/chiffre=# d’ordre de caractérisation de l’enzyme

Question 6

c’est quoi les 4 enzymes qui peuvent être utilisées pour modifier les sticky/blunt ends

Answer 6

1) mung bean nuclease
2) klenow polymérase
3) calf alkiline phosphatase
4) T4 polynucléotide kinase

Question 7

rôle de la mung bean nucléase

Answer 7

enlève le sticky end pour former des blunt
ends

Question 8

rôle de la klenow polymérase

Answer 8

ajoute des nucléotides aux bouts francs pour créer des sticky ends

Question 9

rôle de la calf alkaline phosphatase

Answer 9

dephosphoryle l’ADN

Question 10

rôle de la T4 polynucléotide kinase

Answer 10

phosphoryle l’ADN en présence d’ATP

Question 11

différence entre enzymes de restriction compatibles et non compatibles

Answer 11

compatibles= après le clivage par l’enzyme, les sticky ends sont complémentaires et lient à un l’autre
non compatibles=il faut modifier la séquence d’ADN avec autres enzymes pour rendre les bouts complémentaires

Question 12

3 façons de préparer un insert pour le clonage

Answer 12

1) par digestion avec enzymes de restriction
2) par PCR
3) par synthèse chimique

Question 13

comment on prépare l’insert pour un clonage par PCR

Answer 13

on ajouter des sites de restriction aux amorces PCR qui seront amplifiés grâce au PCR

Question 14

3 étapes du PCR

Answer 14

1) dénaturation du DB
2) hybridation des amorces sur l’ADN
3) élongation par PCR

Question 15

comment la ligation de l’insert et du vecteur se fait

Answer 15

à l’aide d’une ligase (comme T4 ADN ligase par exemple) en présence de Mg2+ et ATP pour créer une liaison phosphodiester

Question 16

c’est quoi la transformation des bactéries

Answer 16

intégration (naturelle ou intentionnelle) d’un fragement d’ADN étranger dans une cellule

Question 17

2 façons de rendre les bactéries prêtes pour recevoir le plasmide (transformation)

Answer 17

1) par choc thermique (traitées au CaCl2)
2) par électroporation

Question 18

2 types de criblages possibles pour la sélection des colonies

Answer 18

1) avoir un gène de résistance à l’antibiotique
2) sélection bleu/blanc avec LacZ et X-gal

Question 19

comment fonctionne la sélection blue/blanc avec Xgal et LacZ

Answer 19

l’insert est integré dans le MCS qui se trouve dans le gène de lacZ.
Donc colonies avec plasmide sont blancs car pas de fonctionnement de LacZ et colonies sans plasmide sont bleues car LacZ fonctionnel et change Xgal en bleu

Question 20

c’est quoi le séquencage sanger

Answer 20

séquencage de l’ADN à l’aide des ddNTPs qui n’ont pas un OH 3’ libre et donc arrêtent la polymérisation

Question 21

3 étapes majeurs du séquencage sanger

Answer 21

1) réaction de PCR
2) produits de PCR
3) migration sur capillaire/électrophorèse

Question 22

5 composantes importantes pour la réaction de PCR pour le séquencage sanger

Answer 22

1) ADN matrice
2) amorces
3) ddNTP
4)dNTP
5)polymérase

Question 23

5 limites du clonage moléculaire classique

Answer 23

-disponibilité des sites de restiction
-compatibilité des sites de restriction
-orientation de l’insert
-inserts contaminants
-chronophage

Question 24

c’est quoi les 3 méthodes de clonages altérnatives

Answer 24

1) clonage TOPO
2) clonage Gateway
3) gibson assembly

Question 25

c’est quoi le clonage TOPO

Answer 25

clonage qui utilise la topoisomérase I pour liger l’insert et le vecteur en créant des liaisons covalentes

Question 26

3 avantages d’utiliser le clonage TOPO

Answer 26

rapide, facile, clonage directionnel

Question 27

c’est quoi le clonage gateway

Answer 27

clonage basé sur la recombinaison homologue entre 2 séquences spécifiques appelées AttB et AttP qui permet le transfert d’un vecteur à l’autre

Question 28

2 avantages pour le clonage gateway

Answer 28

1) permet un transfert directionnel de l’insert entre différents vecteurs
2) utilisé pour applications protéomiques

Question 29

c’est quoi le gibson assembly

Answer 29

technique qui permet l’assemblage de multiples séquences (besoin de overlap de 20-40 nucléotides entre les séquences)

Question 30

3 composantes requises pour le gibson assembly

Answer 30

1) ADN ligase
2) ADN polymérase
3)exonucléase (3’->5’)

Question 31

4 étapes du gibson assembly

Answer 31

1) exonucléase digère les extremités 5’
2) les 2 overhangs sont complémentaires et s’alignent
3) ADN poly rallonge les extremités 3’
4) ADN ligase lie les extremités pour completer le DB