2. DNA replicatie Flashcards
3 mogelijkheden om DNA door te geven
- conservatief
- semi-conservatief : bij de mens
- dispersief
Hoe werkt semiconservatieve doorgeving van DNA ?
dochtercel krijgt DNA : 1 streng van moedercel en 1 nieuw aangemaakte streng
Experiment van Watson en Crick
Inbouw van denser 15N in DNA - samen met bacteriën met lichter 14N in densiteit centrifuge
* Eerste hybride DNA molecule = 50% zware ketens en 50% lichte ketens (1 streng met N15 wordt van de moeder doorgegeven en 1 streng wordt aangemaakt met N14 uit het medium)
* Tweede generatie = DNA heeft nog lagere dichtheid want 1 van de strengen wordt doorgegeven aan de dochtercel maar deze kan maar 1op 2 kansen N15 bevatten
Wat is DNA polymerase?
een enzyme dat instaat voor DNA synthese
* op basis van deoxyrebonucleotiden gaat het DNA aanmaken
* deoxyribonucleoside-monofosfaten activeren door 2 fosfaatgroepen toe te voegen door kinasen
* 3’OH groep nodig om te kunnen polymeriseren want kunnen zelf niet starten met DNA-replicatie
* polymerisatie door alfa - fosfaat - 5’C van bestaande streng een complementaire base te selecteren
* purofosfaat van dNTP wordt verwijderd en verder gehydrolyseerd tot anorganisch fosfaat
Wat is een ORI ?
= origin of replication
* startpunt van DNA replicatie
* strengen gaan uit elkaar en synthese van nieuwe strengen begint
Wat is Helicase ?
- enzyme van 6 moleculen in een ring
- 1 van strengen wordt door ring gehaald waarvoor ATP hydrolyse nodig is
Wat is Topoisomerase I ?
een enzyme dat superwindingen relaxeert door 1 streng te openen waardoor de andere streng vrij kan ronddraaien - later wordt streng terug gesloten
Wat is Topoisomerase II ?
een enzyme dat superwindingen introduceert
* Beide strengen worden verbroken en de tweede helix wordt door de opening gehaald - later wordt origenele helix herstelt
* heeft specifieke inhibitoren die verschillen tussen eurkaryoten en prokaryoten
Wat is Camptothecin ?
> Schors van Campotheca
* anti-tumor agens dat topoisomerase I inhibeert
* replicatie wordt bemoeilijkt
Wat is SSBP ?
= single stranded binding protein
* beschermd enkelstrengig DNA tegen afbraak
Wat is primase ?
- maakt 3’OH uiteinden aan
- RNA polymerase : korte RNA fragmenten complementair maken aan enkelstrengig DNA - die worden vastgehecht met primase
Welke soorten DNA polymerase zijn er (E. Coli) ?
- DNA polymerase III > E. Coli : kan DNA aanmaken van 5’-3’
- DNA polymerase I > E. Coli : gaat primer vervangen door DNA (ook RNA primer aan uiteinde van Okazaki fragment)
Wat is de sliding Clamp ?
eiwit dat DNA polymerase in plaats houdt en zorgt dat synthese processief gebeurt
Welke 3 enzymatische activiteiten zijn er bij DNA polymerase ?
- 5’-3’ polymerase activiteit
- 5’-3’ exonuclease activiteit : RNA primers verwijderen
- 3’-5’ exonuclease voor proofreading
Wat is het princiepe van proofreading ?
- indien foute nucleotide zijn ingebouwd, kunnen er geen correcte waterstofbruggen vormen
- nucleotide niet meer in polymerase site - wel in exonuclease centrum
- het nucleotide wordt afgesplitst
bij juiste nucleotide, wordt conformatieverandering in enzyme geintroduceerd door H-bruggen waardoor polymerase centrum kan werken
Wat is DNA ligase ?
- gaat 2 uiteinden van nicks met elkaar verbinden : 3’OH van DNA dat primer vervangt en 5’ P van DNA
- vergt ATP hydrolyse
Wat is de leading strand ?
de streng die in de 5’-3’ richting loopt
= volledig processief
Wat is de lagging strand ?
de streng die in de 3’-5’ loopt
meerdere korte RNA primers met korte DNA fragmenten ertussen
* RNA wordt verwijderd door DNA poly I > prokaryoten of het herstelpolymerase > eukaryoten
Wat is er speciaal aan het ORI van prokaryoten ?
- specifieke fragmenten genomisch DNA
- veel A-T baseparen
Welke 3 eiwitten zijn betrokken bij de start van replicatie bij prokaryoten ?
- DnaA : initiator proteine
- DnaB : helicase
- DnaC : helicase inhibitor
Hoe ziet de start van DNA replicatie eruit bij prokaryoten ?
- bindt aan 9-mers
- 40 tal DnaA’s gaan complexeren
- grotere torsie op DNA waardoor 13-mers gaat denaturern
- DnaC gaat DnaB afzetten
- 6 DnaB eiwitten gaan een ringstructuur vormen dat DNA uit elkaar kan halen
- ATP hydrolyse nodig
Hoeveel ORI’s zijn er in circulair DNA van prokaryoten ?
1
Hoeveel ORI’s bevat chromosomaal DNA van eukaryoten ?
3.10^4
Hoe vaak start DNA replicatie bij eukaryoten ?
Replicatie start 1x per ORI, per celcyclus
Wat is een ORC ?
=Origin recognition complex
* eiwit complex op elk ORI dat specifieke sequenties herkent zoals cdc6 of Cdk
Wat is cdc6 ?
= cell division cycle
* associeert met ORC in vroege G1 fase
* vormt helicase ringen die een pre-replicatie complex vormen
Wat is Cdk ?
= cycline-dependent kinase
* activeert replicatie-start in de S-faze
* enzymes gaan naar replicatievork (vb. helicase wordt gefosforyleerd)
* verhindert re-replicatie : dissociatie cdc6 van het ORC door fosforilatie en herkenning door ubiquinine/proteasoom systeem
* teveel helicase subunits uit de kern gepompt
* activiteit stopt aan het einde van mitose waardoor cdc6 en helicase niet meer gefosforyleerd worden
Hoe eindigt DNA replicatie bij prokaryoten ?
- bijna alle DNA is gerepliceerd : 2 replicatievorken lopen in elkaar over = 2 DNA cirkels
- 2 dochterchromosomen aan celwand vastgehecht : tijdens celdeling zijn er aanhechtingspunten in elke dochtercel
Hoe eindigt DNA replicatie bij eukaryoten ?
- leading strand wordt processief aangemaakt en de replicatie-machinery komt los van volledig dubbelstrengig DNA
- replicatie lagging strand is discontinu : start bij RNA primer maar einde chromosoom kan niet worden aangemaakt omdat primase niet kan vasthechten dus RNA primer kan niet vervangen worden
- DNA eindigd op deze manier enkelstrengig - oplossing : telomeren (uiteinde wordt langer gemaakt zodat primase wel kan aangrijpen)
- tijdens interfase zal het uiteinde nog steeds enkelstrengig zijn : DNA uiteinde gaat een heel stuk terug het dubbelstrengig DNA binnendringen = tripple helix - ontstaat lasso-structuur waardoor het enkelstrengig DNA niet herkent wordt door DNAse en herstelmechanismen
Wat zijn telomeren ?
herhalingen van korte sequenteis dat ervoor zorgt dat er geen info tijdens de replicatie verloren gaat en beschermt het chormosoom uiteinde
Wat is telomerase ?
een enzym dat korte DNA sequenties aanmaakt a.d.h.v. eigen template (RNA)
* grijpt aan enkelstrengig DNA en verlegt het voor een kort stukje
* proces wordt herhaald zodat men repetitieve sequenties krijgt op het einde
* princiepe : reversed transcriptase
* enkel actief in voortplantingscellen, stamcellen en kankercellen
Wat is reversed transcriptase ?
DNA synthese op basis van RNA template
Wat is PCR ?
= polymerase chain reaction
het is een manier om snel en veel DNA fragmenten aan te maken in vitro
Welke stappen zijn er in PCR ?
- denaturatie : temperatuur tot 95°C
- hybridisatie : 2 oligonucleotide-primers die complementair zijn aan 3’ uiteinden, gaan hybridiseren met 1 van de 2 gedenatureerde strengen, temperatuur zal dalen tot 65°C
- elongatie : 3’OH einde van primer wordt herkent door DNA polymerase waardoor DNA synthese kan opgestart worden met oorsponkelik DNA als template
stappen typisch 25x herhaald
Wat is Taq polymerase ?
DNA polymerase van Thermophilus Aquaticus bacterie dat gekloond is zodat het tegen hoge temperatuur resistent is
