10. DNA technologie

Question 1

Hoe kan men willekeurige breuken aanbrengen in DNA fragmenten ?

Answer 1

• niet-specifieke endonucleasen
• mechanische krachten zoals sonificatie

Question 2

Wat zijn restrictie-enzymen ?

Answer 2

Endonucleasen die vreemd DNA herkennen en afbreken door de fosfodiesterbindingen te hydrolyseren in de ruggegraat van het DNA
* Herkent door palindromische sequentie die 2 blunt ends zal opleveren

Question 3

Wat zijn restrictie-sites ?

Answer 3

Herkenningssequentie voor restrictieve enzymes

Question 4

Wat is EcoRI ?

Answer 4

= E. Coli stam R nummer 1
restrictie enzym van E coli

Question 5

Wat is een probe ?

Answer 5

Voor onderzoek vaak DNA denatureren en dan terug hybridiseren :
* Fragment fluo merken zodat het bij hybridisatie de plaats van zijn complementaire streng aantoont

Question 6

Wat is FISH ?

Answer 6

in situ hybridisatie techniek

Question 7

Wat is gene array analysis ?

Answer 7

Alle cDNAs zijn bekend van mens  afzonderlijke cDNAs op specifiek rasterpunt op draagglaasje gespot : elke positie = 1 specifieke cDNA
Geschikt voor globaal overzicht van genexpressie

Question 8

Wat zijn plasmiden ?

Answer 8

= vector
minichromosomen in bacteriën onder vorm van extrachromosomale, kleine, circulaire, dubbelstrengige DNA’s
* moeten ORI bevatten
* hebben selectieve merker : gen dat codeert voor voordeel van de gastheer (vb. ampicilline of tetracycline resistentie)

Question 9

Wat is een polylinker ?

Answer 9

= multiple cloningsite
Reeks restrictie sites naast elkaar ingebracht

Question 10

Hoe werkt het proces van kloneren ?

Answer 10

• polylinker gevormd : restrictiefragmenten van verschillende kloneringsprojecten in een plasmide kloneren
• plasmide geknipt door restrictie enzym en gemengt met het gewenste fragment
• uiteinde plasmide en fragment zijn compatibel
• hybridisatie en DNA ligase voor de uiteinden te verbinden
• bij elke deling wordt het plasmide gerepliceerd

nieuwste manier : PCR

Question 11

Wat is een insert ?

Answer 11

het DNA fragment dat gekloneerd moet worden

Question 12

Wat zijn de 2 manieren om DNA sequentie te bepalen ?

Answer 12

• enzymatisch
• NGS : next generation sequencing

Question 13

Wat is cDNA ?

Answer 13

= copy DNA
* makkelijkste manier om te weten welke genen ergens tot expressie komen
* alle mRNA’s worden geïsoleerd in oligo-dT kolommen
* polyA staarten worden losgemaakt van de kolom en gehybridiseert met oligo-dT dat als primer zal dienen voor reverse transcriptase
* DNA-RNA hybridens worden verzamelt
* RNA wordt afgebroken van de hybride en vervangen door 2de DNA streng

Question 14

Waarvoor wordt cDNA gebruikt ?

Answer 14

• gekloneerd worden in plasmiden en getransformeerd naar bacteriën
• start van PCR = qRT-PCR
• geanalyseerd voor NGS : RNA seq
• gene arrays

Question 15

Wat is een cDNA bank ?

Answer 15

verzameling van cDNA dat gekloond word in plasmiden en getransformeerd via bacteriën
* seq van volledig ORF kan bepaald worden

Question 16

Wat is qRT-PCR ?

Answer 16

= quantitative reverse transcription PCR
* bepalen concentratie van specifieke mRNA’s

Question 17

Wat zijn toepassingen van cDNA ?

Answer 17

• diagnostische testen
• forensische geneeskunde (mensen zijn vaak heterozygoot voor VNTRs : iedere persoon heeft eigen combinatie VNTR’s)

Question 18

Wat is eukaryote overexpressie ?

Answer 18

= vector via transfectie in cel
* voor expressie van eiwitten in eukaryote cellen
* door sterke promotor, veel TXN van ORF en TLN van mRNA