1a. Bojenje MO✅

Question 1

Šta su boje?

Answer 1

Boje su organska jedinjenja koja sadrže hromofornu grupu (daje jedinjenju obojenost) i auksohromnu grupu (omogućava elektrolitičku disocijaciju molekula i omogućava reaktivnost na ćelijskim molekulama).

Question 2

Navedi kisele i bazne boje

Answer 2

Bazne boje: metilensko plavo, kristal violet, safranin, fuksin, malahit zeleno
Kisele boje: eozin, nigrozin, roze bengal

Question 3

Koji je proces koji prethodni bojenju bakterija?

Answer 3

Fiksiranje je proces koji zaustavlja enzimsku aktivnost, ubija ćelije i dovodi do lepljenja za pločicu, te se ne mogu skinuti sa nje prilikom procedure bojenja.
Fiksiranje može da se vrši brzim prenošenjem pločice iznad gornjeg dela plamena (5-6 puta) ili metanolom, tako što se razmaz prelije metanol, odmah odlije i ostavi da se osuši na vazduhu.

Question 4

Kakva mogu biti prosta bojenja?

Answer 4

Monohromatska - bojenje jednom bojom, pri čemu su sve strukture ćelija isto obojene (npr. bojenje metilenskim plavim)
Metahromatska - bojenje jednom bojom, pri čemu su različite strukture ćelija obojene različito (npr. bojenje toluidinom).

Question 5

Kako se izvodi negativno kontrastiranje?

Answer 5

Negativno kontrastiranje se izvodi pomoću tuša ili nigrozina. Bakterije ostaju neobojene, a pozadina crna.

Question 6

Opisati postupak bojenja metilenskim plavim.

Answer 6

1) Fiksiranje preparata - na predmetnom staklu, na plamenu.
2) Bojenje - Na fiksirani preparat se nanosi 1-2 kapi boje kapaljkom . Potrebno je da boja ostane na preparatu 3-5 min.
3) Ispiranje boje - vrši se vodom. Preparat ostaviti u kosom položaju na filter papiru dok se potpuno ne osuši.
4) Mikroskopiranje - Pri mikroskopiranju upotrebiti prvo malo uveličanje, zatim veliko i na kraju imerziju.

Question 7

Koja diferencijalna bojenja postoje?

Answer 7

Po Gramu i po Ziehl-Neelsen-u.

Question 8

Bojenje po Gramu - uopšteno
- koje bb se boje?
- koji su reagensi?

Answer 8

To je složeno bojenje, koriste se 2 boje i diferencijalno bojenje, jer se bb u zavisnosti od toga kako se boje dele na G + i G - .
Primarna boja - kristal violet (genicijana violet).
Drugi reagens - Lugolov rastvor (razblažen rastvor joda i kalijum jodida), čija je uloga da učvrsti vezu između boje i supstrata.
Treći reagens - 96% etanola; sukcesivnim delovanjem dolazi do obezbojavanja Gram - ćelija, dok Gram + zadržavaju kristal violet.
Četvrti reagens - crvena boja safranin.

Question 9

Kako se boje G +, a kako G - bb?

Answer 9

Gram + ćelije se boje kristal violetom i imaju ljubičastu boju, dok se Gram negativne, izgube ljubičastu boju u procesu obezbojavanja alkoholom i naknadano se, oboje crveno prilikom bojenja safraninom (ili karbol fuksinom).

Question 10

Od čega potiče razlika u bojenju G+ i G- bb?

Answer 10

Razlike u bojenju po Gramu uslovljene su razlikom u ćelijskom zidu Gram + i Gram - bakterija, koji se razlikuje, kako po strukturi, tako i po hemijskom sastavu. Dok je kod Gram + bakterija uglavnom sastavljen od peptidoglikana (90%) i jednoslojan je, kod Gram - je višeslojan i sastavljen kako od peptidoglikana (5-20%) tako i od fosfolipida, lipopolisaharida i lipoproteina.

Question 11

Opisati postupak bojenja po Gramu.

Answer 11

1) Fiksiranje razmaza na plamenu
2) Bojenje preparata kristal violetom - 1, 2 min.
3) Višak boje upijamo filter papirom i dodajemo Lugolov rastvor
4) Odliti Lugolov rastvor i ispirati 96% etanolom, sve dok boja ne prestane da se izdvaja sa pločice
5) Isprati vodom da bi se zaustavila reakcija obezbojavanja
6) Preparate preliti safraninom i ostavite da stoji 30-60 sec
7) Preparate isprati vodom, ostavite da se osuše i posmatrajte pod mikroskopom, pomoću imerzionog objektiva.

Question 12

Bojenje po Ziehl-Neelsen-u - uopšteno
- koje bb se boje? po čemu su karakteristične?
- koje boje i reagensi se koriste?

Answer 12

• Bojenje se koristi za tzv. Acido-alkoholni rezistentne bakterije (AARB) koje zadržavaju primarnu boju i pored odbojavanja alkoholom koji sadrži hlorovodoničnu kiselinu.
• Ove bakterije imaju ćelijski zid koji sadrži visok procenat lipida (do 60%). Hidrofoban ćelijski zid ovih bakterija je nepropustljiv za boje u vodenom rastvoru i zbog toga se pri bojenju ovih bakterija koristi zagrevanje kako bi boja bolje difundovala. Kada se bakterije jednom oboje, odbojavanje ćelija je mnogo teže nego kod drugih bakterija zbog nepropustljivog ćelijskog zida.
• U bojenju po Ziehl-Neelsenu-u primarna boja je karbol fuksin koja se dugo zagreva na preparatu. Nakon hlađenja i ispiranja vodom, preparat se odbojava rastvorom kiseline u alkoholu, koji veoma efikasno ispira boju iz svih ćelija, osim iz acidorezistentnih. Ćelije koje su se odbojile naknadno se boje nekom kontrasnom bojom (npr. metilenskim plavim). Prema tome, AARB se boje crveno, a ostale plavo.

Question 13

Bojenje po Ziehl-Neelsen-u - postupak

Answer 13

1) Pravimo razmaz bakterijskih kultura u 1% rastvoru albumina na mikroskopskoj pločici.
2) Sušimo i fiksiramo preparat
3) Prelivamo preparat karbol fuksinom i zagrevamo dok se ne pojavi para. Boja ne sme da proključa, već mora polako isparavati.
4) Sačekamo da se preparat ohladi
5) Isprati vodom višak boje
6) Odbojavajnje se vrši kiselim rastvorom alkohola koji sadrži HCl.
7) Isprati vodom
8) Preliti preparat metilenskim plavim i ostaviti 2-3 min.
9) Ponovo isprati vodom i ostavite da se osuši pre posmatranja imerzionim objektivom.
AARB - crveno
Ostale bb - plavo

Question 14

Za identifikaciju kog roda se koristi bojenje po Ziehl-Neelsen-u?

Answer 14

Mycobacterium.

Question 15

Koja specijalna bojenja znaš?

Answer 15

Bojenje spora, kapsula i flagela.

Question 16

Bojenje spora može biti po?

Answer 16

Po Šefer-Fultonu i po Hauseru.

Question 17

Bojenje spora po Šefer-Fultonu - postupak

Answer 17

1) Napraviti razmaz kulture
2) Osušiti i fiksirati preparat na plamenu
3) Preparat preliti 5% rastvorom malahit zelenog i ostaviti da preparat bude u kontaktu sa bojom 1-2 min.
4) Pažljivo zagrevati na plamenu da boja polako isparava oko 1 min.
5) Preparat isprati vodom
6) Bojiti preparat 0,5% rastvorom safranina (30-60 s).
7) Preparat ponovo isprati vodom i ostaviti da se osuši na vazduhu.
8) Posmatrati homogenom imerzijom: spore su zelene, a vegetativni deo ćelije je crven.

Question 18

Bojenje spora po Hauseru - postupak

Answer 18

1) Napraviti razmaz kulture
2) Osušiti i fiksirati preparate na plamenu.
3) Preparat preliti rastvorom karbol fuksina, i ostaviti da preparat bude u kontaktu sa bojom 1-2 min.
4) Pažljivo zagrevati na plamenu da boja polako isparava oko 1 min.
5) Postupak ponoviti tri puta
6) Preparat isprati vodom
7) Preparat odbojiti u 2% rastvoru sumporne kiseline u 96%-om etanolu
8) Zatim, bojiti preparat metilenskim plavim.
9) Preparat ponovo isprati vodom i ostaviti da se osuši na vazduhu.
10) Posmatrati homogenom imerzijom: spore su crvene, a vegetativni deo ćelije je plav.

Question 19

Bojenje kapsule može biti po?

Answer 19

Po Oltu i Giemsa-u.

Question 20

Od čega su izgrađene kapsule?

Answer 20

Najčešće od polisaharida, a manji broj bb ima kapsulu proteinske prirode (Bacillus anthracis). Pošto kapsule sadrže visok procenat vode, pri pripremanju preparata za bojenje ne vrši se fiksiranje na plamenu.

Question 21

Bojenje kapsula po Oltu - postupak

Answer 21

1) Kulturu bakterija naneti na čistu mikroskopsku pločicu.
2) Razmaz preliti 2-3% vodenim rastvorom safranina, zagrejati do pojave pare i ostaviti da deluje 2-3 min.
3) Pažljivo isprati vodom, osušiti na vazduhu i posmatrati pod imerzijom. Ćelije će biti crveno obojene, a kapsule će se videti kao neobojene zone oko ćelija.

Question 22

Bojenje po Giemsa-i - postupak

Answer 22

1) Razmaz bakterijske kulture fiksirati metanolom.
2) Kada se razmaz osuši, preliti ga razblaženom Giemsa bojom i ostaviti da deluje 15 min. Giemsa boja je mešavina dve boje: metilenskog plavog (bazna boja) i eozina (kisela boja).
3) Isprati vodom, osušiti na vazduhu i posmatrati pod imerzijom. Ćelije će se obojiti plavo, okolina crveno, a kapsule će se uočavati kao neobojena zona oivičena tankom crvenom linijom.

Question 22

Kako se vrši bojenje flagela?

Answer 22

Bojenje flagela vrši se impregnacijom sa solima srebra.