10- Génétique 6 : diagnostic moléculaire Flashcards
qu’est ce qu’un diagnostic moléculair ?
diagnostic des pathologies causées par des variations pathologiques d’un gène, plusieurs gènes (digénisme) ou de l’épigénome
donner structure acide nucléique
sucre+phosphate+base
charge ADN
négative
nombre de lien hydrogène pour GC
3
nombre de lien hydrogène pour AT
2
en amont du côté 5’ nous avons…
promoteur (codon d’initiation)
qu’est ce qu’une varibialité non pathologique?
toute divergence de séquence ADN chez un individu en comparaison avec la séquence de référence n’étant pas associé à une pathologie génétique
qu’est ce qu’une variabilité pathologique?
MUTATION: changement permanent et transmissible de la séquence ADN causant un phénotype pathologique
une varibialité non pathologique peut-être utile pour..
greffes par exemple!
voir si le patient va rejeter ou non
nombre de variations entre le génome d’un individu et celui de référence
5 à 6 millions
de ces 5 à 6 millions, combien arrive de novo? (absent chez les parents)
70 surveinnent de novo
est-ce que toutes les 5 à 6 variation géné millions ont un impact sur phénotype?
NON
- surviennnet dans régions non codantes (intergéniques, introns) sans affecter expression du gène
- Elles sont despolymorphismes fréquents
- touchent un gène s’exprimant à l’état récessif, sans qu’il n’y ait une seconde variation dans le gène
causes externes de variations génétiques
radiations
uv
cliniques (agents alkylants; chimie)
causes internes variations génétiques
- dépurination
- déamination
- radicaux libres
- erreurs de la polymérase (transcription)
- erreurs réplications et recombinaison
- méthylation
quel endroit est fréquent pour des mutations?
dinucléotides CG (ilots CpG) -C devient méthyle -mehtyl C devient U -U code pour T (20 fois plus fréquent que les autres mutations)
Types de variations non pathologique selon taille du génome; GRANDE
CNV, LINE
variations non pathologique selon taille; MOYENNE
microsatellites
*séquences répétées (souvent cacacacaca)
variations non pathologique selon taille;PETITES
- SNP 1 position de différence par rapport au génome de référence (arrive à tous les 100 nucléotides/single nucleotides polymorphismes ) , - indels (délétions)
les petits réarrangement des variations géné pathologique peuvent être de types… (3)
- substitution (transition et transversion)
- insertion (mutations dynamiques=triplets)
- délétion
les grands réarrangements peuvent être de type … (3)
- insertions
- délétions
- équilibrés
mode de mutation le plus fréquent
**substition
conséquence variation homologue
change un codon pour un autre codant pour le même aa
=silencieux
conséquence variation faux sens (missense)
change le codon pour celui codant pour un autre acide aminé
*plus difficile; peut causer une maladie ou non
quelle est exception d’une variation homologue, la rendant non silencieuse
si interfère avec le site consensus= interfère avec l’épissage
conséquence variation de l’altération du cadre de lecture (frameshift)
insertion ou délétion qui n’est pas un multiple de 3
=modification du codon et de ceux en aval (souvent introduction d’un codon STOP prématuré)
conséquence variation non sens
change le codon pour un codon stop
est ce qu’une variation non sens pourrait ne pas avoir d’impact?
oui dans les grosses protéines mais normalement, sont pathogénique
variation faux sens est pathologique ou non?
variable
variations non sens et frameshift; pathologique ou non?
habituellement pathologique
quels sont les éléments à considérer pour savoir si une variation est pathologique ou non?
- fréquence population (si c’est rare = patho, si c’est fréquent = bénin)
- conservation (retrouvé chez d’autres organisme )
- impact ARNm
- impact protéine
- fonction gène
variation homologue; pahtologique ou non?
normalement non
type de gène uniquement exprimé à état homozygote
récessif
type de gène exprimé à état hétérozygote
dominant
quelles maladies ont des expansions TRÈS grandes?
Steiner, x fragile, friedreich
*mutation dans une portion non codante du gène (UTR, introns)
quelles maladies ont des expansions petites?
Huntington, SCA1, DMOP
*mutation dans portion codante (exon)
décire la technique sels chaotropiques pour isoler ADN
- ADN se fixe à la colonne de verre/membrane
- le reste (protéines, lipides, HC charge neutre= sont solubles dans l’eau)
comment évaluer l’efficacité de l’isolation par densité optique?
on estime la quantité de ADN par le ratio 260 (absorbance max ADN)/280 (absorbance max protéines)
**estime pureté
qu’est ce que le principe d’hybridation?
construire une séquence de nucléotides complémentaires à une portion ADN du patient (sonde)
= elle est marquée (fluroescence, radioactivité)
=détection du signal indique la présence de la séquence complémentaire
qu’est ce que le principe de l’électrophorèse capillaire?
séparer les molécules ADN selon leur taille en les faisant migrer à travers un gel d’agarose
(migre moins loins si gros).
*Avec courant constant, taille des molécules est inversément proportionnel à la distance de migration parcourue :
- grandes molécules parcourent une plus petite distance.
- petites molécules parcourent une plus grande distance.
donner les étapes du Buvardage Southern
1-digestion ADN génomique 2-électrophorèse 3-transfert sur membrane 4-hybridation 5-détection par autoradiographie
meilleure ADN polymérase?
Taq
**toutes les polymérases peuvent faire des erreurs
comment se déroule un cycle de PCR?
dénaturer hybrider (refroidie) dénaturer (réchauffe) **passe de simple brin à double brin =on double quantité ADN à chaque cycle
comment trouver le nombre de molécules ADN produites par PCR?
2^n
*n=nombre de cycles de pcr
applications du PCR-migration
Analyses d’identités génétique;
- instabilités des micro satellites.
- contaminations foeto-maternelle.
- judiciaire.
Insertions et délétions récurrentes
principe du PCR-digesiton
Digestion d’un produit de PCR par une enzyme de restriction qui reconnait une séquence spécifique
*mutation crée ou abolit site de restriction.
applications du PCR digestion
mutations ponctuelles récurrentes
*on trouve un site de restriction créé ou aboli par la mutation que l’on recherche
est-ce qu’un mismatch en 3’permet une extension?
ASPE
non!
extension seulement si match en 3’
nom de la technique incluant un appareil d’électrophorèse très complexe permettant une précision de 1 nucléotide?
séquencage de Sanger.
**Étapes : **
- Amplification PCR.
- Dénaturation.
- Réamplification avec mélange de nucléotides et de nucléotides modifiés qui sont marqués par la fluorescence.
quelle est la caractréstique d’un PCR en temps réel?
réaction PCR et détection du produit en continue!
*discrimination allélique est quantification (relative/absolue)
Applications du séquençage de Sanger
- Gènes avec grand nombre de mutations dispersées à-travers du gène.
- Méthode de choix pour substitutions.
- Bonne méthode pour petites insertions ou délétions.
- Ne détecte pas les grandes anomalies de dosage.
comment fonction la sonde TaqMan?
- sonde possède un rapporteur et un quencheur.
- sonde se lie à ADN et à l’amorce.
- Taq libère rapporteur= fluorescence.
Qu’est-ce que la méthode PCR temps réel pour une discrimination allélique?
- Amorce marquée.
- Sonde marquée.
Même logique que méthodes de PCR traditionnel, mais moins de manipulations.
selon la méthode de PCR en temps réel, un échantillon prend 24 cycles pour atteindre le seuil (RFU) et le deuxième prend 25 cycles. Quel échantillon avait le plus ADN?
le premier!
*Puisque le seuil est le même est fixé pour tous, mais ça prend un cycle de plus au deuxième pour atteindre le seuil. *
le deuxième avait 2 fois moins ADN au départ
Qu’est-ce que la méthode MLPA?
Qu’est-ce que la méthode MLPA?
donner les étapes de la technique de PCR MLPA
- dénaturation
- hybridation des 2 portions de la sonde (1 nucléotide de distance)
- ligation des 2 portions de la sonde par ligase
- amplification PCR de la sonde fusionnée
- électrophorèse capillaire
quelle est la manière la plus simple de pouvoir faire une fragmentation de ADN?
sonication
possible par nébulisation et digestion
nommer les 2 techniques d’amplification en parallèle
PCR-émulsion
PCR-cluster
(permet de faire plusieurs réaction de PCR en même temps de différents ou de même patients)
Que se passe t-il à l’étape d’analyse bioinformatique 1?
génération de plusieurs milliers de séquences d’environ 100 à 150 pb
=les séquences peuvent être attribuées à chaque patient selon un code barre moléculaire.
combien avons de MB et de nucléotides dans exome?
30 MB et 30 nucléotides (soit 20 000 variants)
est-ce que dans ADN foetal analysé la variation est présente également chez la mère?
NON
