Wprowadzenie seminarium Flashcards
RNA czy DNA jets badziej hydrofilne i czemy
RNA bo zawiera Uracyl i rybozę
popularna metoda izolacji całkowitego RNA z komórki.
Chomczyńskiego-Sacchi:
etapy obróbki potranskrypcyjnej
tworzenie czapeczki na końcu 5’
- poliadenylacja końca 3’
- splicing, czyli usunięcie intronów i sklejenie ze sobą eksonów
- redagowanie (editing) zasad azotowych (w przyp. niektórych mRNA)
jak się tworzy czapeczka
Tworzenie czapeczki: przyłączenie reszty 7-metyloguanozyny do pierwszego rybonukleotydu w RNA,
poprzez utworzenie nietypowego wiązania
trójfosforanowego (łączy węgiel 5’ 7-Met-G z węglem 5’ pierwszego rybonukleotydu).
* Dodatkowo zachodzi metylacja grupy 2’ OH rybozy pierwszego i drugiego nukleotydu w łańcuchu pre-mRNA.
* Donorem reszt metylowych w procesach metylacji jest S-adenozyno-metionina (SAM), której regeneracja wymaga kwasu foliowego i witaminy B12 (synteza białek jest więc zależna od tych witamin).
* Utworzenie czapeczki zabezpiecza koniec 5’ mRNA
przed degradacją i stanowi miejsce rozpoznawane
przez rybosom
pcr co potrzebujemy
fragment DNA matrycowego
polimeraza DNA termostabilna
primery
d NTP jako substraty
Primer Forward
słuzy do syntezy nici kodującej
primer reverse
służy do syntezy nici kodującej i plus do jest bliżej kierunku końca 3’
substraty w syntezie cDNA
Synteza cDNA in vitro, w procesie odwrotnej transkrypcji, z wykorzystaniem
całkowitego RNA. Substraty:
1) całkowite RNA
2) primer oligo dT: krótkie (12-18 pz) łańcuchy DNA zbudowane z samych dT
3) mieszanina 4 deoksyrybonukleotydów (dATP, dTTP, dCTP i dGTP)
Reakcję katalizuje enzym: odwrotna transkryptaza.
wielkość produktu reakcji PCR w zależności od substratu
od tego czy matrycą w reakcji PCR jest genomowy DNA czy
cDNA uzyskuje się różnej wielkości produkty reakcji PCR:
✓ dłuższe dla reakcji PCR (matrycą jest genomowy DNA - zawiera introny)
✓ krótsze dla reakcji RT-PCR (matrycą jest cDNA - nie zawiera intronów).
