Metody Flashcards
Co to są enzymy restrykcyjne
to endonukleazy tnące DNA
co robią enzymy restrykcyjne klasy 2
rozpoznają sekwencje palindromowe
Analiza RFLP
Analiza RFLP:
- pocięcie DNA przez enzym restrykcyjny
- rozdział elektroforetyczny fragmentów
restrykcyjnych,
- southern blot uzyskanych odcinków DNA na
membranę nitrocelulozową (nylonową)
- detekcja przy użyciu znakowanej sondy
molekularnej (ekspozycja membrany na kliszę czułą
na promieniowanie X).
gdzie jest zastosowana analiza RFLP
W KRYMINALISTYCE
Na czym polega Southern Blot
Pocięcie DNA enzymami restrykcyjnymi na fragmenty.
Rozdział elektroforetyczny fragmentów DNA w żelu.
Southern Blot - fragmenty DNA są przenoszone z żelu na membranę nitrocelulozową (lub nylonową) na zasadzie sił
kapilarnych. Nici DNA zostają trwale związane z membraną i występują w postaci pojedynczych łańcuchów.
Hybrydyzacja - inkubacja membrany nitrocelulozowej (nylonowej) z sondą molekularną (odcinek ssDNA znakowany
32P ). Sonda wiąże się specyficznie w miejscu, gdzie w membranie występuje fragment DNA o komplementarnej
sekwencji. Nadmiar sondy zostaje odpłukany.
Detekcja - ekspozycja membrany na kliszę czułą na promieniowanie X - zaczernienie kliszy w miejscu związania
się znakowanej sondy.
W biologii molekularnej i biotechnologii powszechnie wykorzystuje się metody pozwalające na detekcję różnych
specyficznych cząsteczek. Mogą to być sekwencje DNA (metoda Southern blot), RNA (Northern blot) lub białek
(Western blot).
Na czym polega metoda FISH
- hybrydyzacja in situ (bezpośrednio w tkance) z wykorzystaniem znacznika fluorescencyjnego
- Metody te pozwalają na zidentyfikowanie w komórce obecności konkretnej sekwencji na chromosomach. Polega na hybrydyzacji
utrwalonych komórek z sondą molekularną DNA (w przypadku FISH sonda jest wyznakowana znacznikiem fluorescencyjnym).
Detekcja - z zastosowaniem mikroskopu. W przypadku FISH detekcja zachodzi przy zastosowaniu mikroskopu fluorescencyjnego, co
zwiększa czułość metody.
