Week 3 (Protein purification and Analysis) Flashcards
Combien de protéines différentes est-ce qu’il y a dans un organisme?
entre 10’000 et 100’000
Est-ce qu’une gène peut produire plusieurs protéines ?
Oui
Que sont les trois méthodes de purification d’un mélange de protéines ?
- Chromatographie par gel-filtration
- Chromatographie par échange d’ions
- Chromatographie d’affinité
Quel principe de séparation utilise la chromatographie par gel-filtration ?
La taille des protéines
Quel principe de séparation utilise la chromatographie par échange d’ions ?
La charge des protéines
Quel principe de séparation utilise la chromatographie d’affinité ?
L’affinité spécifique des protéines
Comment fonctionne la chromatographie par gel-filtration ?
Le petites molécules peuvent pénétrer les billes poreuses mais pas les grosses. Les grosses s’écoulent du coup plus vite.
Comment fonctionne la chromatographie par échange d’ions ?
Des billes de charge négatives sont dans la colonne. Les protéines positives se lient aux billes négatives . Les protéines de charge globale négative passent plus vite.
Comment fonctionne la chromatographie par échange d’ions ?
Des billes d’une substance sont dans la colonne. Les protéines qui ont une affinité pour ses substances vont se lier et être ralentit
Que sont les acide aminés qui absorbent le plus fort la lumière?
- La tryptophane
- La tyrosine
Les Aromatiques
Que sont plusieurs méthodes d’analyse de protéines ?
- Mesurer la concentration
- Electrophorèse sur gel de polyacrylamide
- Sequençage de protéines
- Détection avec des anticorps
- Spectrométrie de mass
- Trouver sa structure tridimensionnelle
Comment fonctionne l’électrophorèse sur gel ?
Une solution de protéines est placée dans des puits en haut d’une fine plaque de polyacrylamide. Un champ électrique passe à travers le gel et fait qu’une charge négative est en haut et une charge positive. Les SDS se lient ensuite aux acides aminés des protéines et dénaturent les protéines. Les protéines sont toutes chargés négativement. Les protéines les plus légers descendent plus vite que les lourds
La mobilité dans le SDS-PAGE est proportionelle a quoi ?
Au logarithme de leur masse
Qu’est le nom de la substance qui colore les protéines ?
le bleu de Coomasie
Que peut on faire pour améliorer la résolution des protéines sur un gel SDS-PAGE ?
D’abord on fait passé notre solution de protein dans un gel a gradient pH avec un champ électrique. Les protéines se sépare à travers la solution jusqu’à atteindre leur point isoélectrique (pH ou la charge globale vaut 0). Ensuite en fait un SDS-PAGE avec ce gel.
Le gel avec gradient a un ph de 9 en haut et pH3 en bas (pH 9- , pH3+)
Comment déterminer la composition en acides aminés d’un peptide/protéine?
- Hydrolise du peptide (destruction des liaisons peptidiques) avec de l’acide chlorhydrique, 100C, 24h
- Séparation des acides aminés par chromatographie liquide à haute pression (HPLC)
Comment peut-on déterminer la séquence d’AA d’un peptide/protéine ?
Oui, avec la dégradation de Edman.
1. Le résidu N-terminal est marqué
2. Le résidu marqué est séparé par l’isothiocyanate
3. Le residu séparé est analysé par HPLC
Y’a-t-il une limite pour séquencer des protéines ?
Environ 50. Car dans chaque étape seulement 98% des protéines libère le résidu N-terminal
Comment sequencer toute une protein ?
Le cliver à certain bouts. Surtout faire deux réactions avec des clivages différents puis avec la dégradation d’Edman afin de pouvoir comparer le clivage des deux réactions pour reassembler la séquence de la protéine.
Comment fonctionne la méthode de détection de protéines basées sur des anticorps ?
L’anticorps détecte un antigène spécifique sur la protéine.
Cette méthode est utilisé pour le Western Blot où l’anticorps qui se lient à la protein est radioactif et donc détectable lors d’un SDS-PAGE
Quand est utilisé le faite de mesurer la concentration d’un mélange ?
Pour quantifier une protéine pure
Quand est-ce que l’électrophorèse sur gel de polyacrylamide (SDS-PAGE) est utilisé ?
Lorsqu’il s’agit d’analyser des protéines dans un mélange
Quand est-ce que le séquençage des protéines est utilisé ?
Pour analyser la séquence primaire des protéines
Quand est-ce que la détection avec des anticorps est-elle utilisée ?
Pour identifier des protéines spécifiques dans un mélange
Quand est-ce que la spéctrométrie de masse est-elle utilisée ?
Pour déterminer la masse moléculaire d’une protéine
A quoi sert la cristallographie par rayon X ?
Pour trouver la structure tridimensionnelle
