Week 3 Flashcards
Soorten blotting
Methode om grote biologische moleculen op een drager (gel) waardoor de moleculen kunnen worden gescheiden en gedetecteerd
3 soorten:
- northern blotting: RNA-moleculen detecteren
- southern blotting: DNA-moleculen detecteren
- western blotting: eiwitten scheiden op basis van molecuulgewicht
cDNA
een dubbelstrengig DNA molecuul, dat in basevolgorde overeenkomt met een rijp mRNA.
Gesynthetiseerd door reverse transcriptase enzym met als beginnetje een stuk poly-T, wat aan de poly-A staart plakt.
cDNA niet bevat geen promotor en introns i.t.t. DNA
Moleculaire hybridisatie
de vorming van een dubbele helix uit twee enkelstrengige nucleïnezuren (probe) met een homologe nucleotidenvolgorde, gebruikt om RNA te blotten
Een probe is een bekend stuk enkelstrengig DNA dat kan hybridiseren met een specifiek enkelstrengig DNA of RNA molecuul (cDNA)
Fluorescente in situ hybridisatie (FISH)
DNA wordt voorzichtig gedenatureerd met behoud van de zichtbare chromosoomstructuur. Vervolgens wordt een specifiek stuk enkelstrengs DNA (een probe) dat tevoren is gemarkeerd aan de chromosomen gehybridizeerd, waarmee de homologe chromosoomregio’s zichtbaar gemaakt worden.
Telomeren
Gesynthetiseerd door telomerase:
-TERT (TElomerase Reverse Transcriptase), eiwit-componenten
-TR (Telomerase RNA-component), RNA-template gedeelte
bevind zich in chromosomen stamcellen en cellen in de kiembaan (deze kunnen zich dan vaker delen)
N.B. Bij kanker is telomerase overactief; hierdoor oneindige replicatie mogelijk.
Soorten chromosomale afwijkingen?
- Numerieke afwijkingen
- Structurele afwijkingen
- Deleties met als gevolg het missen van een deel van een chromosoom
- Dicentrische chromosomen
door straling of telomeer erosie
=> Gen amplificatie
=> Door overproductie specifiek gen
Accentrische chromomen komen vrij bij vorming diccentrische chromosomen
=> microkernen
Vogelstein model
Model over het ontstaan van darmtumor. Het gaat uit van een niet- of slechtfunctionerend APC-eiwit, waardoor er ongeremde celdeling is inclusief secundaire mutaties.
Micro-array technologie
Techniek waarmee expressie profiel van genoom wordt gemaakt. Wordt gebruikt als men niet weet welk gen ten grondslag aan een aandoening ligt.
APC-eiwit
Tumorsuppressorgen; remt de celdeling (beta-catecine, TCF4, cycline D)
Ziektebeeld: FAP
- inactieve mutatie, waardoor geen rem meer op celdeling
Structurele chromosoom afwijkingen
Gebalanceerd:
- translocatie
- inversies (180 graden flip van stuk DNA; para- en pericentrisch)
- inserties
Niet-gebalanceerd:
- deletie (terminaal of interstitieel)
- amplificatie
- niet-gebalanceerde translocatie (dicentrische chromosomen)
- gen mutatie (base)
Dicentrische en accentrische chromosomen werking
Bij dubbelstrengs breuken kunnen chromosomen op andere manier worden geligeerd; bij mitose wordt chromosoom gekke manier uit elkaar getrokken. Hierdoor kan ontstaan:
chromosoom met 2 centromeren of zonder centromeer, circulaire chromosomen etc.
Numerieke chromosoomafwijkingen
Monosomie: chromosoom te weinig
Trisomie: chromosoom te veel
Verschil tussen AML en CML
Bij AML alleen onrijpe blasten in perifeer bloed; bij CML komen alle stadia van celrijping voor in het perifeer bloed.
Welke chromosoomafwijking bij CML?
Translocatie (9;22)
Ontstaan BRC-ABL fusie gen, -mRNA en -eiwit
Wat voor therapie bij CML?
- Imitinab; remmer van het BRC-ABL gen
- andere -nabjes
- stamceltherapie
Waarom kan CML overgaan in AML?
Er ontstaan secundaire mutaties in de genen naast de BRC-ABL mutatie
Wat zijn cyclines, CDK’s en CKI’s?
Cyclines zijn eiwitten zonder enzymatische activiteit;
CDK’s binden hieraan voor activatie, soms nog extra (de-)fosforylering nodig
CKI’s zijn remmers van CDK. Initiatie gebeurd door DNA-schade en/of groeifactoren. Vooral actief in G1.
Welke volgorde heeft de celcyclus?
G1: groeifase
S: duplicatie DNA
G2: voorbereiding
M: celdeling
Welke checkpoints heeft de celcyclus en welke eiwitten spelen een rol?
Restrictiepunt G1-fase - cycline D-cdk4-complex:
- doorlopen celcyclus
- RB-E2F, waarbij ongebonden E2F actief is en leidt +cycline E en -D/CDK4
G1-S-fase - cycline E-cdk2-complex
- DNA-schade controle
- p53 eiwit (mutatie => replicatie DNA-schade; RDS fenotype)
Intra S-fase - cycline A-cdk2-complex:
- DNA-schade
- ATM (mutatie => replicatie DNA-schade; RDS fenotype + AT)
G2-M-fase:
- DNA-schade en replicatie controle
Tijdens anafase: cycline B-cdk1-complex
- controle rangschikking chromosomen
- BUB1 en MAD1 in spanninggevoelig-eiwitcomplex; bij schade verhoogde spanning (mutatie => aneuploidie)
Relatie tussen DNA schade en kanker?
- Fasen celcyclus
- Genen celcyclus
- Checkpoints calculus
Wat is ataxie telangiecia (AT)?
Wat is Nijmegen Breuk Syndroom (NBS)?
Wat is RAD50 en waarom is die belangrijk?
Bij dubbelstrengs breuken houdt RAD50 de verschillende uiteinden van de streng bij elkaar zodat de breuk kan worden gerepareerd.
Wat is een RDS fenotype?
Radioresistent DNA Schade fenotype;
Door straling ontstaat er schade in DNA; in gezonde cellen wordt de celcyclus gestopt en de schade hersteld. Bij RDS is er een mutatie in RAD50, NBS1 of ATM, waardoor de celcyclus door blijft gaan en de DNA-schade dus wordt gedupliceerd. Dit leidt tot expressie in het fenotype.
Werking imatinib
Remmer van BRC-ABL; hierdoor toepassen bij AML op basis van BRC-ABL.
N.B. Langdurig gebruik leidt tot resistentie
Welke vormen cytogenetische afwijkingen?
- Klassieke cytogenetica (karyotypering)
- Moleculaire cytogenetica (FISH, SNP array)
- Moleculaire diagnostiek (op DNA niveau, bv PCR)
Wat is LOH?
Loss Of Heterogenosity; verlies van heterogeniteit
Stel allel A en allel B in normaal DNA, dus AB. Bij een mutatie veranderd A in B of vice versa, waardoor AA of BB ontstaat.
Circadiane klok
Interne biologische klok van een organisme;
Afhankelijk van licht
Werking klokgenen en klokeiwitten
Nut circadiane klok
