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Genetik Und Biotechnologie > Vorlesung 5 > Flashcards

Vorlesung 5 Flashcards

1
Q

Eigenschaften von Vektoren

A
  • Befähigung zur autonomen Replikation
  • hohe Kopienzahl
  • selektionierbare Marker (Antibiotika Resistenz)
  • relativ geringe Größe
  • Multiple Klonierungsstelle
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2
Q

Antibiotika

A

-bakteriostatisch (Wachstumshinderung) oder bakteriocid (abtöten)
- ß-Lactam-ANtibiotika aus Pilzen: Hemmung der bakteriellen Zellwandsynthese z.B. Ampicillin oder Penicillin
-Streptomycin, Chloramphenicol, Tetracyclin aus Bakterien: Hemmung der Proteinsynthese

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3
Q

Resistenzgene von Bakterien

A

amp (ß-Lactamase). SPaltung des Penicillin Rings
CAT (CHloramphenicol-Acetyl-Transferase)
tet: Hemmung der Aufnahme von Tetracyclin in Bakterien

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4
Q

Nachweis von klonierter Fremd-DNA in Plasmiden

A
  1. Insertionsaktivierung
  2. alpha-Komplementation (Blau-Weiß-Selektion)
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5
Q

Insertionsaktivierung

A

Nach Ligation der Fremd DNA in den Vektor sind nur gegnüber einem Antibiotikum resistent, wenn sie vorher gegen zwei resistent waren

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6
Q

alpha-Komplementation (Blau-Weiß-Selektion)

A

Ursprungszustand: Plasmid mit lacZa und Chromosom mit lacZ-Gen werden transkribiert und translatiert -> alpha-Fragment bildet mit dem Rest des lacZ_Proteins eine aktive ß-Galactosidase -> diese metabolisiert X-Gal und es bildet sich ein blauer Farbstoff
Veränderte Plasmide: lacZa wird gespalten durhc eingebrachtes Gen, nach transkiption und translation bildet sich kein alpha-Fragment, ß-Galactosidase ist inaktiv -> x-Gal kann nicht metabolisiert werden und die BAkterien bleiben weiß

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7
Q

Klonierung eines menschlichen Gens in ein bakterielles Plasmid

A
  1. menschliche und Plasmiden DNA werden beide mit dem gleichen Restriktionsenzym geschnitten
  2. DNAs verbinden sich durch BAsenpaarung
  3. DNA-Ligase knüpft kovalente Bindungen (Zugabe)
  4. Plasmid wird in lacZ bakterium eingeführt
  5. Zeleln werden auf Ampicillin und XGal Medium gegeben
  6. Kolonien mit rekombinanten Plasmid werden durch ihr Wachstum auf AMpicillinhaltigem Medium und ihrer weißen Farbe identifiziert, isoliert und vermehrt
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8
Q

Gen-Bibliothek

A

Gesamtheit von DNA-Fragmenten eines kompletten Genoms, welche stabil in Plasmide integriert wurde

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9
Q

Hertsellung einer Gen-Bibliothek

A
  1. DNA Probe und Plasmide werden mit dem gleichen Restriktionsenzym geschnitten
  2. Fragmente und Plasmide werden gemischt und durch die DNA-Ligase verknüpft
  3. Gemisch aus Plasmiden entsteht, bei den jeder Plasmid ein unterschiedliches Fragment des Genoms enthält
    4.Bakterien nehmen Plasmide auf und wachsen in einem Nährmedium, das die rekombinanen Klone selektiert.
  4. Kolonien mit nur einem einzigen kloniertem Fragment der ursprünglichen DNA werden in Reinkulturen gezogen. Jede dieser Kulturen ist ein Buch in der Genbibliothek
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10
Q

Problematik der Gen-Bibliothek

A

Eukaryotiche Gene sind groß und durch Introns unterbrochen
Prokariotische Organismen haben keine Introns können und eukaryotische Gene nicht eprimieren
-> Lösung cDNA = komplementäre DNA

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11
Q

Produktion von cDNA

A

1.DNA wird in mRNA umgewadelt, dabei werden Introns entfernt und Exons verspleißt
2. mRNA wird aus der Zelle isoliert und reverse Transkriptase wird hinzugegeben
3. cDNA wird synthethisiert ohen vorhandene Introns
4. RNA wird abgebaut

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12
Q

Polymerasekettenreaktion (PCR)

A
  1. DNA-Molekül mit Zielsequenz wird zur Denaturierung erhitzt (94 Grad)
  2. Primer binden bei Abkühlung an die einzelsträngige DNA (50 Grad)
  3. dNTPs und die DNA-Polymerase werden hinzugegeben für die Synthese der neuen DNA-STränge (72 Grad)
  4. Der Vorgang wiederholt sich bis sich die DNA-Menge verdoppelt hat
  5. Durch die WIederholung können zahlreiche Kopien in kürzester Zeit erstellt werden
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13
Q

DreI Schritte des PCR-ZYklus

A

Denaturierung der DNA (94 Grad)
Hybridisierung der Primer (45-65 Grad)
Synthese der neuen DNA-Stränge durch Taq-Polymerase (72 Grad)

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14
Q

Bestandteile des PCR

A

DNA-Moleküle
DNA-Polymerase
Primer
Nukleotide

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15
Q

Vier Arten um die Genexpression zu untersuchen

A
  1. Nothern-Hybridisierung
  2. RT-PCR
  3. Mikroarray-Analyse
  4. Substraktive Hybridisierung
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16
Q

Northern Hybridisierung

A

Ähnlich zum Southern Blot, hier wird jedoch RNA geblottet, anstatt DNA

17
Q

RT-PCR

A

Kombination von Reversen Transkriptasen mit dem Verfahren der PCR um RNA nachzuweisen
1. Gesamte RNA wird aus Zellen isoliert
2. Oligo(dT)-Zellulose trennt mRNA von restlichen RNA-Typen
3. RNA wird in DNA (cDNA) umgeschrieben
4. PCR-Verfahren wird gestartet

18
Q

Mikroarray Analyse

A

Dient der Identifikation und Aktivitätsmessung bestimmter Gene

19
Q

Subtraktive Hybridisierung

A

Isolierung von mRNA, die nur unter bestimmten Bedingungen exprimiert wird
1. Medium mit mRNA die unter experimentellen Bedingungen gewachsen ist
2. Medium mit mRNA die unter STandardbedingungen gewachsen ist
3. Standardbedingung mRNA wird extrahiert und cDNA wird hergestellt
4. Experimentelle mRNA wird extrahiert und auf einen Filter gegeben
5. cDNA wird denaturiert und an den FIlter gebunden
6. Die meisten mRNAs binden, die spezifischen für bestimmte Wachstumsbedingungen passieren den Filter

20
Q

DNA-Sequenzierung

A

Bestimmung der Basenabfolgen an einem Genom (Reihenfolge von Adenin, Guanin, Thymin und Cytosin)

21
Q

Kettenabbruchverfahren nach Sanger

A
  1. Einzelsträngige DNA unbekannter Sequenz dient als Matritze
  2. Markiertes Primer Molekül wird hinzugegeben
  3. In 4 reaktionslösungen gegeben (+ DNA-Polymerase + Stopp Nukleotide)
  4. dATP, dCTP, dTTP. dGTP werden hinzugefügt und sorgen für den Abbruch der Synthese
  5. Durchführung einer Gelelektrophorese (kurze DNA Stücke wandern weiter nach unten als lange)
  6. Makierte Banden werden nachgewiesen
  7. Der neu synthetisierte STrang wird ausgelese
  8. Matritzen Strang wird abgeleitet

Genetik Und Biotechnologie (13 decks)

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