Vorlesung 4 Flashcards
Induzierende Gene: Beispiel Lactose ist nicht vorhanden
- Der von Gen i codieret Repressor blockiert die Transkription indem er an den Operator bindet
- Die RNA-Polymerase kann nicht an den Promotor binden; die Transkription ist blockiert
- keine mRNA wird erzeugt, also wird auch kein Enzym hergestellt
Induzierender Gene: Beispiel Lactose ist vorhanden
- Lactose bindet an Repressor, dieser kann dann nicht an den Operator binden
- Transkription wird induziert
- RNA-Polymerase bindet an den Promotor
- solange der Operator frei vom Repressor ost, kann die RNA Polymerase die Strukturgene der Enzyme transkribieren
Katabolit-Repressoren
Positive Kontrolle der Transkription durch den CAP-cAMP komplex (catabolic activator protein)
-> Glukose kann ebenfalls lac-Operon kontrollieren
Rolle von Glukose in der Regulation des lac-Gens
Glukose steuert den cAMP-Spiegel in der Zelle (hemmt Adenylatcyclase, welche ATP in cyclisches AMP umwandelt) = cAMP Spiegel sinkt wenn viel Glukose in der Zelle vorhanden ist
Wenn Glukosespiegel niedrig, steigt der cAMP Spiegel in der Zelle und bindet an CAP Protein, welches dann an die CAP-Bindungsstelle bindet und somit eine aktive und effiziente Transkription ermöglicht
Zwei Typen von Operons und Aufgabe
- Induzierbare Operons (lac Operon): kodieren Enzyme für einen Stoffwechselweg, werden vom Substrat des Stoffwechselweges reguliert, das den Abbau induziert
- Reprimierbare Operons (trp-Operon): kodieren Enzyme, die an Biosyntheses beteiligt sind und werden vom Produkt des Reaktionsweges reguliert. Repressor kann nur mit Co-Repressor binden
Endprodukthemmung (Feedback Hemmung): Tryptophan nicht vorhanden
- das regulatorische Gen r produziert einen inaktiven Repressor, der nicht an den Operator binden kann
- die RNA-Polymerase transkribiert die Strukturgene, durch die Translation entstehen Enzyme des Tryptophansyntheseweges
Endprodukthemmung: Tryptophan vorhanden
- Tryptophan bindet an den durch Gen r produzierten Repressor = aktiver Repressor
- der Repressor bindet am Operator
- Tryptophan verhindert, dass die RNA-Polymerase an die Tsrukturgene bindet und diese transkribiert, und blockiert so die Synthese der Enzyme des Tryptophansyntheseweges
Vergleich induzierbare und reprimierbare Operons
Induzierbar (z.b. lac-Operon): lac Repressor wird durch Laktose (Induktor) inaktiv
Reprimierbar (z.B. trp-Operon): trp-Repressor wird durch Tryptophan (Co-Repressor) aktiv
Regulation der Genexpression (Eukaryoten)
Methylierung und Histon-Deacetylasen: Methylierung an CG stellen, methylcytosinbindendes Protein tritt hinzu, Histon-Deacytelase bindet an MeCP
Initiation der Transkription (Eukaryoten)
- TFIID bindet an die TATA-Box
- Weiterer Transkriptionsfaktor kommt hinzu (B)
- RNA-Polymerase II bindet nur, wenn bereits einige Transkriptionsfaktoren an die DNA gebunden haben
- Weitere Transkriptionsfaktoren werden hinzugefügt (E,H)
- Komplex kann mit der Transkription beginnen
Koordinierung der Transkription (Eukaryoten Stressproteine)
- Stressfaktor führt zur Aktivierung der Transkription von Genen für Stressproteine
- Die Bindung von Regulatorproteinen an die Sequenz des Stress-Response-Elements stimuliert die Transkription der Gene A B C die verschiedene Proteine Synthesizern, die an der Stressreaktion beteiligt sind
Enhancer
Enhancer Sequenzen liegen weit vom Transkriptionsstart entfernt
Durch Bindung von spezifischen Transkriptionsfaktoren kann
Plasmide
Kleine ringförmige eigenständige DNA Moleküle
Gene die im Hauptmolekul nicht vorkommen
Tragen ein oder mehrere Gene
Verleihen der Zelle nützliche Eigenschaften
Herstellung von Plasmiden
Plasmid wird aus Bakterium isoliert und DNA mit gewünschtem Gen wird aus Zelle isoliert
Gen wir DIN Plasmid eingebaut
Plasmid wird in Bakterienzelle transferiert
Zellen mit dem gewünschten Gen werden kloniert
Verwendung von Plasmiden
ENTWEDER: Genkopien werden isoliert und auf andere Organismen übertragen -> Gen verleiht Bakterien die Fähigkeit Schadstoffe zu beseitigen, Gen für Schädlingsbekämpfung wird in Pflanze eingebracht
ODER: produziertes Protein wird isoliert -> Protein löst Blutgerinnsel nach einem Herzinfarkt, Wachstum Hormon zur Behandlung von Zwergwuchs
Schritte zur heterodoxen Expression eines Gens
- Isolation des gewünschten Gens
- Erzeugung eines rekombinanten Plasmids
- Transformation
- Selektion
- Regulierte Expression des heterologen Gens
Benötigte Materialen Gentechnik
- Restriktionsendonukleasen
- Ligand
- Vektoren (Plasmide)
- Wirtsorganismen
Wichtigste Schritte der DNA-Klonierung
- Ligation: Verbindung von Vektor und DNA-Fragment
- Transformation: Transport des rekombinierten DNA-Moleküls in die Wirtszelle
Restriktionsendonukleasen
Schneiden DNA und werden genutzt um in dringende Viren zu bekämpfen
1. Enzym schneidet Phagen DNA
2. Andere Enzyme bauen Phagen DNA zu noch kleineren Fragmenten ab
3. Methylgruppen an den Retsriktionsstellen blockieren das Restriktionsenzym und schützen die bakterielle DNA vor dem Zerschneiden
Besonderheit Typ II Restriktionsendonukleasen
Erkennen bestimmte Abfolgen von Sequenzen auf der DNA und schneiden dort
z.B. Palindrom Schnittstellen am 3’ und 5’ Strang (EcoRI)
Unterschiedliche Enden durch Restriktionsendonukleasen
stumpfe (blunt) Enden -> Pvul
kohäsive (sticky)Enden -> EcoRI
Auftrennung der Fragmente durch Gelelektrophorese
- Gel aus Agarosepolymer wird in einer Wanne aufgetragen (besitzt zwei Pole, oben - unten +)
- DNA Lösungen werden in die Geltaschen gefüllt
- die ersten beiden Lösungen sind mit einem anderen Enzym versehen, welches die DNA anders schneidet (AUfteilung)
- die dritte Lösung beinhaltet beide Enzyme, daraufhin wird die DNA in dreiAbschnitte geteilt
- DNA Fragmente wandern auf die positive Elektrode zu, kürzere Elemente wandern schneller und weiter
- Fragmente werden durch UV-Licht sichtbar gemacht
Southern Blot
- Ein Geld wird in eine basische Lösung gegeben, welche die DNA denaturiert
- Eine Nylonmembran nimmt etwas von der DNA aus dem Gel auf; so entsteht ein Blot
- Die Membran wird in eine Lösung gegeben und eine radioaktiv makierte DNA-Sonde wird zugesetyt
- Die Sonde hybridisiert mit ihrer spezifischen Zielsequeny in der denaturierten DNA
- Autoradiographie erstellt einRöntgenbild
Verknüpfung von DNA-Molekülen
Ligasen (in der Gentechnologie T4 DNA-Ligase)
glatte Enden+überhängende Enden -> ineffektiv
glatte Enden+glatte Enden -> annehmbare Ausbeuten
zwei passende +berhängende Enden -> sehr effektiv
