VL 5:NGS Flashcards
Welches dieser Projekte wäre am besten für Next Generation Sequencing geeignet?
- Zu bestimmen, ob ein Tumor eine bestimmte missense-Mutation aufweist?
- Das Transkriptom eines Tumors zu bestimmen
- Eine genomische DNA Probe nach einigen bekannten SNPs zu untersuchen
- All of the above.
B: Transkriptoms eines Tumors
zu A: um bestimmte Sequenz zu identifizieren nimmt man Sanger, bei vielen Basen/dem ganzen Genom eher NGS
Welcher dieser Schritte ist wichtig für die Erstellung eines Templates für Next Generation Sequencing?
- DNA Isolierung
- Zerkleinern der DNA in kleinere Fragmente
- Überprüfen der Qualität und Quantität der DNA Fragmente
- All of the above.
D. All above
Nachdem Sequenzen eines Next Generation Sequencing Experimentes erhalten wurden – was tun Sie
zuerst?
- Bioinformatische Analyse der Daten
- Validierung der Daten mit einer unterschiedlichen Methode
- Publizieren der Resultate
- Weitere Analysen einzelner Sequenzen
A. Bioinformatische Analyse der Daten
Was bedeutet „Brückenamplifikation“?
Spezielle lokale Amplifikation auf einer Oberfläche bei z.B. Solexa/Illumina Seq.
- > Oberfläche ist mit Oligos (Primern) übersäht, die Adapter der Fragmente können je an einer Seite mit den Primern auf der Oberfläche revers-komplementär hybridisieren.
- > Die Primer werden dann von der Polymerase verlängert und ein Doppelstrang entsteht.
- > Die DNA-Fragmente beugen sich mit ihrem freien Adapter zu dem Primer hin und bilden eine „Brückenform”, daher der Name
Wie unterscheiden sich 454 und Illumina NGS Techniken?
454: Prinzip der Pyrosequenzierung (ATP wird aus ASP synthetisiert mit Hilfe der energiereichen Esterbindung des Pyrophosphats APS + PPi -> ATP)
- > Auswertung mit Luciferase (Lichtblitze entstehen proportional zur ATP-/PPi-Menge)
- -> Leselänge ca. 400-500 Basen, langsamer als Illumina (menschliches Genom kann in 1 Monat komplett sequenziert werden)
Minituarisierung: Öl und Wasser Sequenzierung: Pyrosequenzierung
Illumina: Brückenamplifikation und Sequencing by synthesis
- > außerdem wird von beiden Seiten gelesen (paired-end), Auswertung via Laser (eingebaute Fluorophoren in den 3´-Enden der Nukleotide generieren Cluster-Unterscheidung anhand der Farbe)
- > Leselänge: 20-300 Basen, 67 Gigabasen können an einem Tag gelesen werden (ca. 20 menschliche Genome)
Minituarisierung: Oberflächen PCR
Welches Reaktionsprodukt der DNA-Kettenverlängerung wird für die Visualisierung der
Pyrosequenzierung genutzt?
Pyrophosphat (PPi) entsteht als Nebenprodukt bei der DNA-Kettenverlängerung
DNAn + dNTP -> DNAn+1 + PPi
Dieses PPi enthält noch eine energiereiche Esterbindung und bei der Zugabe von Adenosinphosphosulfat (APS) kann mit Hilfe des PPi aus APS ATP synthetisiert werden
APS + PPi -> ATP
DNA wird aus menschlichem Blut extrahiert und zehn Gene von Chromosom 22 werden amplifiziert. Die
PCR Produkte werden aufgereinigt und mit der Sangermethode sequenziert. An bestimmten Positionen
in der Sequenz treten Ambiguitäten auf. Wieso?
Ambiguität = Doppel-/Mehrdeutigkeit
-> Unterschiedliche Allele da der Mensch diploid (2n) ist, also einen doppelten Chromosomensatz besitzt
Dasselbe PCR-Produkt wurde mit der Illuminaplattform sequenziert. In den einzelnen Sequenzier-reads
gibt es keine Ambiguität mehr. Warum? Welche informatische Analyse machen Sie, um Ihre Hypothese
zu testen?
Illumina benutzt nur ein Template/Allel, es wird Base für Base sequenziert
-> Jeder read für sich ist eindeutig
Während der Pyrosequenzierung werden dNTPs nacheinander hinzugefügt. Dazu gehörten dCTP, dGTP,
dTTP und dAMPαS (dies ist ein Analogon von dATP). Warum müssen wir das Analogon hinzufügen und
nicht dAMP selbst während der Sequenzierungsreaktion?
Da normale dARPs mit Luciferase interagieren würden zur Produktion von Oxyluciferin und dadurch ein false-positive Ergebnis entstehen würde.
Nennen Sie zwei wesentliche Vorteile von SMRT (single molecule real time sequencing).
- Sehr lange reads möglich
- keine hochmodifizierte DNA-Polymerase nötig (sondern WT)
- keine Amplifikation/PCR nötig
