VL 1: Klonierung Flashcards
Was sind Klone?
- Genetisch identische Organismen oder Moleküle, die auf einem gemeinsamen Vorfahren beruhen
Varianten von Klonierung
- *Artifizielle Klonierung:**
- Reproduktives Klonieren: Das gesamte Tier wird ausgehend von einer Zelle durch asexuelle Reproduktion erstellt
- Therapeutisches Klonieren: Kein identisches Individuum, sondern Erstellung von Gewebe (aus somatischen Zellen, die mit mRNA behandelt werden entstehen Stammzellen –> Züchtung eines Organs)
- Genklonierung: Gene oder Genfragmente werden kloniert
- *Natürliche Klonierung:**
- Klonieren von einzelligen Organismen durch Isolierung
- Pflanzliche asexuelle Replikation (Apomixis)
- Zwillinge
Klonierung aus Einzelzellen in Pflanzen
Gewebe wird isoliert und in einzelnen Zellen dissoziiert –> Zellen werden in Wachstums Medium tra nsferiert –> Zellen werden aufgeteilt um einen Kallus zu bilden –> Zellen werden in ein neues Medium transferiert um Wurzel- und Sprossbildung zu induzieren –> Pflanzen werden in Erde transferiert –> Genetisch identische bzw. geklonte Karotten entstehen von einem einzigen Vorfahren
Klonierung von Tieren:
- Embryo splitting
- Kerntransfer
- *- Embryo Splitting:** Embryo wird in 2 Halb-Embryos geteilt –> Embryos werden in eine Leihmutter inseriert –> Tier bekommt 2 identische Zwillinge (nicht sehr effizient)
- *- Kerntransfer:** Kern wird aus Eizelle entfernt –> Kern aus somatischer Zelle (Körperzelle) wird eingefügt –> Überführung der Zelle in Leihmutter
Probleme der Klonierung
- Geringe Lebenserwartung/ Krankheiten
- Unterschiede wegen somatischer Mutationen
- Niedrige Erfolgsrate: 0,1-3%
- Dedifferenzierung nicht komplett
- Telomere können verkürzt sein
- Mitochondrien können defekt sein
Klonierung von Genen
Ziel: Vereinzeln, um zu manipulieren und zu verfielfältigen.
Gen –> Klonierungsvektor –> Wirt –> Verfielfältigung
Restriktionsenzyme
Das Restriktionsenzym EcoRI bindet an die Erkennungssequenz und schneidet DNA in Fragmente mit “Sticky Ends” (erkennen palidromische Sequenzen)
Shotgun Klonierung
A: Ein ausgewähltes Restriktionsenzym schneidet eine spez. Basen Sequenz überall wo sie vorkommt in einem Chromosom oder in cDNA
B: Dasselbe Enzym schneidet dieselbe Sequenz in Plasmid DNA
D: Die Plasmid DNA hat auch Sticky Ends
E: Die Plasmid DNA und die chromosomale DNA werden in einer Lösung gemischt mit weiteren Enzymen, die sie verknüpfen
F: Eine Sammlung an rekombinanten Plasmiden, die fremde DNA enthalten.
G: Wirtszellen die sich schnell vermehren können nehmen die rekombinanten Plasmide
Was sind Vektoren?
Plasmide, um DNA Fragmente zu klonieren
Stringgentes Plasmid: teilt sich nur wenige Male währrend des Zellzyklus von E.coli
Relaxierte Plasmide: teilen sich ständig
Nachteile des traditionellen Klonierens
- verfügbare Restriktionsschnittstellen sind limitierend
- Multiple Arbeitsschritte (zb. Gelaufreinigungen von DNA-Fragmenten)
- Transfer von Inserts von einem Vektor zum nächsten meist nicht trivial (zb. auch um den Leserahmen zu erhalten)
Topo Klonierung und ihre Vorteile
Topoisomerasen vom Typ IA schneiden einen der beiden Einzelstränge und führen den anderen durch die Lücke –> sind gleichzeitig Endonuklease und Ligase
Vorteile:
- per PCR kann man das Insert exakt definieren, keine mühsame Suche nach Restriktionsschnittstellen
- Ligation ist hocheffizient (ca.90%)
Gateway Klonierung
beruht auf dem sequenzspezifischen Rekombinationssystem des Phagen λ (Bakterienvirus), der mittels bestimmter Enzyme seine DNA in das Genom des Bakteriums E.coli integriert.
Der Integrationsprozess wird von der Integrase des λ-Phagen katalysiert, dieser Vorgang benötigt spez. Sequenzabschnitte in der Ziel DNA, zw. denen die gen. Information eingefügt werden können.
Für die Exzision des DNA-Fragments wird das Enzym Exzisionase benötigt.
1) Kompatibilität zw. Vektoren
2) Erhalt des Leserahmens
3) Eliminierung von Restriktionsenzymen, Gelaufreinigung, Ligation
4) Hochdurchsatzmöglichkeit
Essentielle Merkmale des Lambda-Systems
- die Insertion und Exzision benutzt dieselben Sequenzen, aber unterschiedliche Enzyme:
- Integration (attB x attP): Integrase (Int) und host integration factor (IHF). Es entstehen die Stellen attL und attR, die den integrierten Prophagen flankieren
- keine DNA Sequenzen gehen verloren
- Exzision (attL x attR): Integrase (Int); host integration factor (IHF); Excisionase (Xis): es entstehen attB in E.coli und attP in lambda
Gateway Entry Clone
1) Das zu exprimierende Gen muss zererst mit den attB-Rekombinationsstellen versehen werden, diese werden von an der Rekombination beteiligter Enzyme erkannt.
2) Austausch des im Donor-Vektor enthaltenen ccsB-Gen gegen das PCR-Produkt. An der zw. PCR-Produkt und Donor-Vektor erfolgenden BP-Reaktion sind die Enzyme Integrase und IHF beteiligt.
Gen muss amplifiziert werden, Attach-Sides am Primer –> Vektor enthält kompatible Sides die mit Gen rekombinieren können
ccdB: tötet Bakterien mit diesem Plasmid (Gyrase-Hemmer)
Gateway Expression Clone
3) Erzeugung des Expressions-Vektors: Reaktion zw. Entry-Clone und Zielvektor. Zielvektor kann an der 5’ oder 3’ der attR-Seiten die entsprechende Sequenz für eine Genfusion tragen.
Gibson Klonierung
Fragmente mit Überlänge und denselben Enden –> Exonuclease verkürzt einen Strang –> freigewordene Sequenzen können miteinander paaren –> Polymerase verlängert die DNA und schließt Lücke
Vorteile: -besonders lange DNA-Sequenzen können vermehrt werden,
-einzelne DNA-Sequenzen werden weder bevorzugt noch benachteiligt
