VL 4: QPCR Flashcards
Sie haben einen in Wasser gelösten DNA Einzelstrang. Was müssen Sie hinzufügen, um
einen komplementären Strang zu synthetisieren?
Primer, Nukleotide, thermostabile Taq-Polymerase, Puffer
Welche zwei Erfindungen machen es möglich, dass die PCR kostengünstig und effektiv in
jedem Labor eingesetzt werden kann?
- Primer können günstig gekauft werden
- Nachdem man aus dem thermostabilen Bakterium Thermus aquaticus die erste thermostabile Taq-Polymerase gewonnen hat, konnte der ganze PCR-Prozess erheblich vereinfacht und automatisiert werden.
Ein Forscher hat den ORF von GFP amplifiziert und neben einen Promoter von E. coli in
einen Vektor kloniert. Er kann jedoch keine Fluoreszenz in mit diesem Konstrukt
transformierten Bakterien entdecken.
A: Welche verschiedenen Typen von Mutationen
können in der PCR passiert sein?
B: Welches ist die wahrscheinlichste und warum?
C: Wie würden Sie zeigen, dass es wirklich eine Mutation war und nicht ein Problem mit
dem Bakterienstamm, den Sie zur Expression genutzt haben?
a. Punktmutationen (Missense/Nonsense)
b. Zu viel/zu wenig Basen werden von Polymerase eingebaut (Deletion/Insertion):
FrameShift Mutation, der Leserahmen verschiebt sich:
-> Später translatiertes Protein verliert meist seine ursprüngliche Funktion
c. Mit anderem Bakteriemstamm vergleichen und gucken, ob das Konstrukt fluoresziert
Der “cycle threshold” ist:
a. Die Gesamtzahl an Zyklen einer real-time PCR Reaktion
b. Der Zyklus, an dem eine Sonde einen bestimmten Punkt in der real-time PCR Reaktion
erreicht
c. Die Zyklenzahl, an der die Probe die Plateauphase der PCR erreicht
d. Keine Antwort richtig
B
Ein PCR Zyklus besteht aus
a. drei Schritten: Denaturierung, Primer annealing, Elongation
b. drei Schritten: Denaturierung, Initiation, Elongation
c. drei Schritten: Primer annealing, Elongation. Termination
d. drei Schritten: Initiation, Elongation, Termination
A
Nach vier Zyklen einer PCR-Reaktion, wie viele Moleküle sind vorhanden, wenn man mit
einem DNA-Duplex angefangen hat?
a. 16 einzelsträngige DNA Moleküle
b. 16 doppelsträngige DNA Moleküle
c. 18 einzelsträngige DNA Moleküle
d. 18 doppelsträngige DNA Moleküle
B: 2*n n= Zyklusanzahl)
Ein PCR Primer ist 18 Basen lang; Wie häufig wird er ans menschliche Genom binden?
a. (3.3 x 109)x(18)
b. (3.3 x 109)/18
c. (3.3 x 109)/418
d. (3.3 x 109)/218
e. 418
f. (3.3 x 109)/ (¼)18
C:Größe des menschlichen Genome (3,3 Mrd bp) / Wahrscheinlichkeit der 4 Basen-Typen ^18 Basen langer Primer
Sie wollen eine 22,345 Basenpaar-lange Region des Mausgenoms mit PCR amplifizieren.
Sie erstellen Primer mit 20, bzw. 22 Basen Länge, die identische Schmelztemperaturen
haben. Es gibt nach der Reaktion leider kein Amplifikat. Warum?
a. Primer haben nicht dieselbe Länge
b. Zielregion zu groß
c. Primer zu kurz
d. Hier wird versucht Maus-DNA zu amplifizieren, das geht aber nur mit menschlicher
DNA
e. Sie haben mehr als einen Primer in ihrer Reaktion benutzt
B
Die ideale Temperatur für Taq-Polymerase ist _______ C°.
a. Raumtemperatur
b. 37
c. 42
d. 72
e. 95
72°C
Welche dieser Reagentien sind typischerweise nicht Teil einer PCR_Reaktion?
a. NTPs
b. MgCl2
c. Ethidium bromide
d. DNA primers
e. E. coli DNA polymerase
A. (NTPs sind Ribonukleotide, DNA-Pol braucht dNTPs)
C. (nur für die Detektion/Auslese nach der Reaktion)
E. (wir wollen Taq-Polymerase, nicht E coli - Polymerase)
Was würden Sie erwarten, wenn Sie in einer PCR die Temperatur in der Annealingphase
erhöhen und die Elongationsphase verlängern?
a. Präzision und Ertrag sind reduziert
b. Präzision und Ertrag sind erhöht
c. Präzision ist reduziert, Ertrag ist erhöht
d. Präzision ist erhöht, Ertrag ist erniedrigt
B
Was würden Sie erwarten, wenn man in einer PCR Primer verwendet, die etwas kürzer
sind und einige variable Stellen aufweisen?
a. Die PCR Reaktion würde nicht beginnen
b. Die PCR Reaktion würde nach dem ersten Zyklus enden
c. Die Reaktion würde ein einziges, kurzes PCR Produkt ergeben
d. Die Reaktion würde eine Mixtur unterschiedlicher Produkte ergeben
D
A. 5’ nach 3’ Elongationsaktivität der Taq Polymerase
B. 5’ nach 3’ Exonukleaseaktivität der Taq Polymerase
C. beide
- __A__ erzeugt Phosphodiesterbindungen
- __B__ schneidet
- __D__ schneidet Wasserstoffbindungen
- __A__ ist Primer-abhängig
- __D__ baut die Primer zu Mononukleotiden
____ Während die PCR läuft, steigt die Fluoreszenz ab einem bestimmten Zeitpunkt in beiden Ansätzen.
Welcher Prozess erklärt dies?
A. TaqMan Sonden werden zu Nukleotiden abgebaut
B. TaqMan Sonden werden zu kleinen Oligonukleotiden abgebaut
C. TaqMan Sonden werden als intakte Oligos vom Template gelöst
D. TaqMan Sonden dienen als Primer für die Taq-Polymnerase
E. TaqMan Sonden werden in den neu synthetisierten DNA-Strang eingebaut
A. TaqMan Sonden werden von der Taq-Polymerase zu Mononukleotiden abgebaut
- Für die folgenden Fragen gilt:
A. wenn A größer als B ist
B. wenn B größer als A ist
C. wenn die beiden gleich groß sind
13.9. __A__
Die Zahl der freien Primer in Probe A nach 4 Zyklen
Die Zahl der freien Primer in Probe A nach 10 Zyklen
13.10. __B__
Die Zahl der freien Primer in Probe A nach 10 Zyklen
Die Zahl der freien Primer in Probe B nach 10 Zyklen
13.11. __B__
Die Zahl der TaqMan Sonden in Probe A nach 10 Zyklen
Die Zahl der TaqMan Sonden in Probe B nach 10 Zyklen
13.12. __B__
Die Zahl der TaqMan Sonden in Probe A nach 18 Zyklen
Die Zahl der TaqMan Sonden in Probe B nach 18 Zyklen
13.13. __C__
Die Zahl der Farbstoffmoleküle in Probe A nach Zyklus 18
Die Zahl der Farbstoffmoleküle in Probe B nach Zyklus 18
13.14. __A__
Die Zahl der Amplifikate in Probe A nach 20 Zyklen
Die Zahl der Amplifikate in Probe B nach 20 Zyklen
13.15. __C__
Die Zahl der Amplifikate in Probe A nach 30 Zyklen
Die Zahl der Amplifikate in Probe B nach 30 Zyklen
13.16. __A__
Was gilt für das dem Amplifikat in A zugrunde liegende Template
Seine Kopienzahl ist ungefähr 30 mal häufiger als in B
Seine Kopienzahl ist ungefähr 5 mal häufiger als in B
Seine Kopienzahl nahm ungefähr 30 mal ab relativ zu B
Seine Kopienzahl nahm ungefähr 5 mal ab relativ zu B
Seine Expression nahm um den Faktor 5 ab
…
