VL 2: CRISPR Flashcards
Was passiert in einer Zellen, nachdem Cas9 geschnitten hat, aber kein DNA template für homologe Rekombination mitgeliefert wurde?
NHEJ (Non-homologous end joining): Mechanismus zur DNA-Reparatur von Doppelstrangbrüchen (Beide Fragmente werden einfach wieder zusammen geklebt nachdem Schnitt durch insertion/deletion. Dabei passieren oft Fehler: mehrere Basen fallen raus, andere werden hinzugefügt etc.: Mutationen)
→ ist gewollt, die Zelle repariert sich dann kaputt & Gene funktionieren nicht mehr (werden ausgeschaltet) → KD
→ Bei diploiden, menschlichen Zellen kann die zweite „Kopie” zur Reparatur benutzt werden
Das CFTR-Gen codiert für das Protein Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance
Regulator (CFTR). Dieses Genprodukt fungiert in der Zellmembran als Chloridkanal.
Durch die Veränderung im Gen wird ebenso das Protein verändert, und die Kanalfunktion
bleibt aus oder ist eingeschränkt. Wie kann Cas9 in der Gentherapie eingesetzt werden,
um cystische Fibrose zu heilen?
→ durch einen viralen Vektor kann eine gesunde Kopie des CFTR-Gens in die Zielzellen eingebracht werden, dieses wird dann durch die erkrankte/fehlerhafte ausgetauscht
→ im Gegensatz zur Non-homologous end joining (NHEJ) benötigt man bei der Homology directed repair (HDR) eine Donor DNA (Template), welche von Cas9 mitgebracht wird
Welche enzymatische Aktivität hat Cas9?
→ kann DNA-Doppelstrang schneiden, besitzt Doppelstrang Endonuklease Aktivitäten:
HNH und RuvC (Endonukleasedomänen), welche jeweils einen der Einzelstränge schneiden
CRISPR repeats finden sich in A. bakterieller DNA B. viraler DNA C. Pilz-DNA D. viraler RNA
A: bakterieller DNA
Welches der folgenden Proteine wurde nicht für Genomeditierungen genutzt? A. ZFN B. TALENs C. CRISPR-Cas9 D. MHC
D: MHC Haupthistokompatibilitätskomplex (von engl. major histocompatibility complex); Gruppe von Genen bei Vertebraten, die Proteine codieren, welche für die Immunerkennung, die Gewebeverträglichkeit (Histokompatibilität) bei Transplantationen und die immunologische Individualität wichtig sind.
CRISPR Sequenzen im Zielgenom werden erkannt durch A. Zinkfingerdomänen B. TALE repeats C. RNA D. Leucin zipper
C: RNA (sgRNA)
Wofür steht die Abkürzung “CRISPR”?
Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats
Wie wird die guide RNA für die Genomeditierung hergestellt und welche Rolle spielt sie
für den Prozess?
→ aus crRNA (crispr RNA) + tracrRNA (trans-activating crRNA) = (single) guide RNA
→ Cas9 bindet zwei RNA, die crRNA und die tracrRNA, während bei der Methode nur eine aus Sequenzen der beiden RNA bestehende sgRNA verwendet wird
→ Dadurch muss für die CRISPR/Cas-Methode nur eine RNA kloniert werden
→ Eine sgRNA besteht aus den 20 Nukleotiden strangaufwärts (in 5’-Richtung) von einem Protospacer Adjacent Motif (PAM) der zu schneidenden Ziel-DNA und einem Teil der tracrRNA.
→ Cas9 mit gebundener RNA (Komplex) erkennt und bindet komplementär an die Ziel-DNA-Sequenz, leitet also Cas als Endonuklease an die zu schneidende Stelle
Wie unterscheidet sich CRISPR-Cas9 fundamental von anderen
Genomeditierungswerkzeugen?
durch Versuch “KO-Mäuse” wird die effiziente schnellere Genomeditierung deutlich (1 Monat statt 6 Monate)
→ das Ändern der Spezifität benötigt nur ein neues Oligo (sgRNA) , jedoch kein neues Proteindesign wie bei TALENs und ZFN
→ KO (knockout) statt KD (knockdown) wie z.B. bei RNAi
Welchen Vorteil haben andere Genomeditierungswerkzeuge gegenüber CRISPR/Cas9?
→ die Länge der Zielsequenz kann bei anderen Genomeditierungswerkzeugen einfacher und besser designed werden
→ kann länger sein als bei CRISPR/Cas
→ Die Spezifität ist limitiert durch die Länge der crRNA-Ziel Homologie
→ die Länge des RNA-DNA-Hybrides (ca. 20bp) kann zwar verändert werden, aber nur sehr begrenzt
→ weniger/keine off-target-Effekte
Hinweis: RNAi ist besser, um ein Gen mit essentieller Genfunktion nicht komplett zu zerstören, sondern nur lahmzulegen (z.B. ein Gen, das essentiell ist für die Funktion von Ribosomen, keine Ribosomen = Zelle stirbt)
Cas9 muss in seiner Sequenz verändert werden, um es zur Editierung von eukaryotischen
Genomen zu verwenden. Inwiefern?
tracrRNA muss Ziel-DNA erkennen (tracrRNA wird an CRIPR angefügt und dieser Komplex dann an das Cas9)
Kernlokalisationssequenz muss hinzugefügt werden, damit Cas9 vom Cytoplasma in den Kern gehen kann (?)
Wie können Phagen der CRISPR-Abwehr ausweichen? Nenne zwei Alternativen.
→ Zielsequenz der crRNA des Bakteriums oder die Cas9/PAM Sequenz mutiert
→ Anti-CRISPR/Cas9 Proteine
→ Virus integriert in den Cas9 Locus
CRISPR/Cas Loci sind auch in Phagengenomen gefunden worden. Welchen Vorteil
könnte der Phage davon haben?
→ Um andere Phagen auszuschalten, eine Art Konkurrenz-Verringerung, um mehr Bakterien befallen zu können (Evtl. evolutive Anpassung an diese Abwehrmethode der Bakterien, wie eine Art Resistenz gegen das bakterielle CRISPR/Cas9)
→ Vermeidung von Doppelinfektion
