VL 1: Klonierung Fragen Flashcards
Warum spielen Mitochondrien eine Rolle für den Erfolg des Klonierens beim Kerntransfer, aber nicht beim Embryo Splitting?
Da beim Kerntransfer erfolgt ein Transfer vom Zellkern einer Zelle ( bei Dolly Euterzelle) in die Eizelle eines anderen Tieres, wo zuvor der Zellkern entfernt wurde. Da nur die Eizelle Mitochondrien hat und die Befruchtung nur mit einer einzelnen befruchteten Eizelle erfolgt, ist das Vorhandensein des Mitochondriums in der Eizelle sehr sehr wichtig. Mitochondrien hat eigenes DNA, was mit dem Kern zusammenspielt.
Beim Embryo Splitting erfolgt eine Spaltung der Embryo ab einem Mehrzellstadiun(zb 6 od. 8 Zellstadium). Hierfür sind zwar Mitochondrien auch sehr wichtig, allerdins befinden sich die Zellen in einer permanenten Teilungsphase, was das Fehlen von Mitochondrien in einzelne Zellen weniger problematisch macht.
Wie kann man ausschließen, dass Dolly durch eine nicht erkannte Befruchtung entstanden ist?
Die Leihmutter(3te Mutter) ist phänotypisch verschieden vom Dolly.
Weiße Kolonien, aber kein längeres Insert nach Restriktionsverdau? Wieso?
Während der Klonierung hat eine Exonuclease einen Teil entfernt (zb. 1bp) –> Leseraster verschiebt sich (frame-shift)
LacZ ist kaput
2 Plasmide werden fusioniert: kann so nicht isoliert werden aus E.coli, warum?
2 ORIs im Produkt funktioniert nicht –> Replikation geht nicht weiter
Plasmide, die multi-copy vorliegen, nennt man
a) Stringente Plasmide
b) Relaxierte Plasmide
c) kryptische Plasmide
d) Alles falsch
b) Relaxierte Plasmide (nicht mehr gekoppelt an die Replikation)
Verbinden Sie die Vektoreattribute und die Funktion. Nicht alle Antworten müssen genutuzt werden.
________Restriktionsstelle
________Replikationsursprung
________Promotor
________Antibiotikaresistenz
A) Wird für die Expression des Inserts gebraucht
B) Erlaubt die Insertion von DNA in den Vektor
C) Kodiert ein Enzym, dass DNA schneidet
D) Erlaubt Selektion von Bakterien, die den Vektor aufgenommen haben
E) Wird zur Duplikation des Vektors benötigt
F) Wird für die Bindung von SRP benötigt
G) Ribosomenbindestelle
B) Restriktionsstelle
E) Replikationsursprung
A) Promotor
D) Antibiotikaresistenz
Wie können sie ohne Restriktionsenzyme klonieren?
TA-Klonierung über TA Plasmide mit Thyminnukleotid dass als sticky end wirkt.
Welche Art Enzyme brauchen Sie, um mittels Gateway-Technologie zu klonieren?
Integrase (Einbau von DNA in ein Genom), Exzisionase (Lyse des DNA Fragments), IAF (Integration Factor –> keine enzymatische Aktivität)
Nennen sie ein wichtiges Problem der Gibson Klonierung
Einzelstränge falten mit sich selber, so dass eine Faltung mit 2 Einzelsträngen nicht mehr möglich ist, Qualität des Primers (Punktmutaionen), Problem für die Hybritisierung (passen nicht mehr zsm.)
Um das Gen zur Komplementation einer Tryptophan-Biosynthesemutante (Name: NY-trpZup) von E. coli zu finden, konstruieren Sie eine genomische Bibliothek von WT E. coli, indem
Sie das Genom mit BamHI schneiden und die Fragmente in das Plasmid pGoSOX! Klonieren.
pGoSox! Enthält Gene für Tetracyclin und Kanamycin Resistenz und hat eine BamH1-
Schnittstelle, die innerhalb des Kanamycinresistenzgens liegt. Sie transformieren die
Bibliothek in NY-trp-Zup Zellen und plattieren sie auf Vollmedium. Sie replizieren die
Kolonien auf verschiedene Medien, wie unten gezeigt. Die Platten sind alle in derselben
Orientierung gezeigt.
i) Welche Kolonie(n) enthält/halten den originalen pGoSOX!?
ii) Welche Kolonie(n) tragen pGoSOX! Plus Insert?
iii) Welche Kolonie(n) würden Sie wählen, um das Gen für Tryptophanbiosynthese zu
analysieren, für das NY-trp-Zup defizient ist?
iv) Was sind Kolonien 2 und 6?
Mit Stempel werden die Kolonien auf die 3 anderen Platten mit verschiedenen Medien plattiert
i) 3, 4, 5
ii) 6
iii) 1 (Resistent gegen Fehlen von Trp, enthält Plasmid auf jeden Fall, während 2 kein Plasmid hat (Revision der Trp Produktion
iiii) Frame shift Mutation oder etwas ähnliches
Welche enzymatischen Aktivitäten brauchen Sie für Golden Gate Klonierungen?
Restriktionsenzyme (Endonukleasen –> Typ 2s –> schneiden neben der Bindungsstelle) (erkennen und schneiden DNA ), Ligasen (verknüpfen DNA )
