Vježba 15 Flashcards
kaj koristimo (plazmid, bakterija, gen koji ugrađujemo)
plazmid: pGLO
bakterija: E. coli HB101
gen: GPF (green fluorescent protein)
kakav agar se koristi i kaj sve sadrži
LB agar –> triptofan, sol, kvašćev ekstrakt, agar
kak radimo petrijevke
bez DNA: LB+bakterije, LB+bakterije+ampicilin
s DNA: LB+bakterije+ampicilin, LB+bakterije+ampicilin+arabinoza
kak arabinoza oboji rezistentne bakterije
zeleno
kad se koristi metoda PCR
dok želimo imati više kopija jedne DNA
koja je ključna činjenica u PCR-u
DNA se na višim temp ne uništava nego se odvajaju lanci, pri nižim temp se ponovno spajaju
kaj je sve potrebno za PCR
DNA primer (za početak sinteze) dušične baze DNA polimeraza (Taq polimeraza - otporna na visoke temp)
proces u PCR-u
- povisi temp - razdvajanje lanaca
- snižavanje temp - primaza se spoji na jednostruke lance
- sinteza drugog lanca
- povišenje temp, rastaljivanje novog lanca za aplifikaciju
gdi se čuvaju dobiveni geni u PCRu
u DNA bibliotekama
kakva DNA se može koristiti pri PCRu
bez introna (jer bakterije nemaju introne niti ih prepoznaju)
kak se dobiva DNA bez introna
reverznom transkriptazom
kaj je reverzna transkriptaza
DNA polimeraza koja stvara DNA lanac prema mRNA –> nastaje DNA komplementarna mRNA, bez introna
kak se zove DNA koju sintetizira reverzna transkriptaza
cDNA (copy DNA –> nema introne)
zakaj se koristi PCR pri detekciji virusne/bakterijske infekcije
jer je u serumu preniska razina virusne DNA, pa se treba umnožiti da bi se detektirala
iz čega je sintetizirana Taq polimeraza
thermus aquaticus
u DNA imamo sekvence koje kodiraju za
proteine, tRNA, rRNA, siRNA
koje su nekodirajuće sekvence DNA
regulatorne sekvence (pojačivači, utišivači...) junk DNA (introni, repetitivna DNA)
na kaj se dijeli repetitivna DNA
visoko ponovljene sekvence
srednje ponovljene sekvence
kaj su visoko ponovljene sekvence
satelitna DNA - centromere, telomere
kaj su srednje ponovljene sekvence
minisateliti
mikrosateliti
retrotranspozoni
kaj su minisateliti
ponavljajuća sekvenca od 1-20 kb
kak se naziva čitava regija kod minisatelita
VNTR (variable number of tandem repeats
da li varijabilnosti VNTR-a utječu na fenotip
Ne
kakav je VNTR od osobe do osobe
karakteristični su za svakog pojedinca
kaj se dobije dok endonukleazom pocijepas DNA i dobijes dijelove različitih duljina
fragmenti RFLP (restriction fragment lenght polymorphism) - sadrže te VNTR koji su različitih duljina
kad, osim nasljeđivanjem, mogu nastati minisateliti
mogu nastati sporadično - pojava SNP (single nucleotide polymorphism) koji mijenja jedan nukleotid - može nastati mutacija ako je na egzonu
minisateliti služe i ko markeri za
specifične gene –> može se pratiti prijenos gena za određene bolesti
kaj su mikrosateliti
sekvence dužine 1-6 parova baza
kak se zovu regije koje sadrže nekoliko mikrosatelita
STR (short tandem repeats)
kak se nasljeđuju STR fragmenti
kodominantno
kak bi se homozigotni i heterozigotni STR pokazivali na elektroforezi
homozigotno - jedna linija
heterozigotno - dvije linije
koliko se u STR lokusa koristi u forenzici (kolko dvije osobe ne mogu imati zajednička)
13
koji je cilj hibridizacije nukleinskih kiselina
pronaći u DNA biblioteki sekvencu koja kodira za nekaj čemu znamo slijed baza, ali ne lokus
kakva DNA se koristi kod hibridizacije
jednolančana - dobijemo ili visokom temperaturom ili upotrebom alkalne otopine
koji mehanizam se koristi pri hibridizaciji nukleinskih kiselina
imamo pretraživačku sondu - jednolančana DNA s točno određenom sekvencom koja ima neki biljeg (najčešće 32P koji fluoriscira)
FISH
fluorescent in situ hybridisation - koristi se DNA s 32P biljegom koji će uzrokovati fluorescenciju ako se spoji s komplementarnim DNA lancem
jesu li sve hibridizacije iste točnosti
ne - razlikujemo one visoke točnosti (potpuno komplementarni lanci) i one smanjene točnosti (uzvojnice koje nisu potpuno komplementarne)
kaj znači in situ
na licu mjest - kod FISH-a to znači unutar jezgre/citoplazme (ne treba izolirati DNA)
koja metoda se zna koristiti u preimplantacijskoj dijagnostici
FISH
vrste blottinga
dna - southern
rna - northern
proteini - western
kak funkcionira blotting
endonukleaza razvoji DNA na fragmente razdvoje se elektroforezom lanci se razdvoje u alkalnoj otopini inkubiraju se sa sondom komplementarni lanci traže se autoradiografijom
kad se koristi blotting
za dokazivanje postojanja određene molekule
sekvenciranje DNA je
određivanje redoslijeda nukleotida
dvije metode za sekvenciranje DNA
sangerova dideoksi metoda
maxam-gilbertova metoda
kak funkcionira sanger dideoksi metoda
stavimo u 4 epruvete jednolancanu DNA, radioaktivni primer, normalne nukleitde i dideoksirivonukleozidforfate za svaku bazu koji će zaustaviti polimerizaciju na točno određenoj bazi
za kaj bakterije koriste CRISPR Cas 9 metodu
za imunost
basic funkcioniranje CRISPR Cas 9
razrezivanje DNA virusa i smještanje u CRISPR lokus
proizvodnja RNA od tih fragmenata - crRNA
Cas 9 (endonukleaza) koju uzmjerava crRNA reže virusnu DNA pri ponovnom kontaktu
kompleks za razrezivanje virusne DNA kod CRISPR
crRNA
Cas9
trans-aktivirajuća RNA (trRNA)
kaj treba Cas 9 za svoje funkcioniranje
PAM domenu - ona je neposredno nakon 3’ kraja sekvene koju trebamo izrezati