Virusdiagnostik Flashcards
Vilka är dem 4 grundläggande labmetoderna för diagnostik av virus?
- Odling/isolering
- Antigenpåvisning
- Genompåvisning/molekylärbiologiska metoder
- Serologi (antikroppar)
Isolering/odling
- nackdelar?
- fördelar?
Nackdelar
- dyrt
- arbetskrävande
- långsamt, resultat 1-7 dagar
- görs i en cellkultur pga virus behöver cell för replikation
Fördelar
- hög sensitivitet. Vissa specifika virus framför allt se bild.
- Vissa virus växer inte alls - HBV, HBC, Norovirus Parvovirus, Papilllomvirus
Antigenpåvisning
- hur ser metoden ut?
- Vilka virus kan vara lämpliga för denna diagnostik?
Metod
- monoklonala antikroppar tillsätts till provet. T.ex. NPH, feces
- avläsning kan ske på olika sätt
1. färgomslag (visuellt, snabbtest),
2. fluorescens
3. enzymmärkta antikroppat (spektrofotometer) = ELISA
Virus som är lämpliga
- HBV
- HBC
- HIV
- SARS-Cov2, influensavirus, RSV i NPH
- Rota,noro,adenovirus i feces
Fördel och nackdel med antigenpåvisning som metod?
Fördel
- god tillförlitlighet vid bra prov
- Högt PPV - högt positivt prediktivt värde. Andel av dem som är positiva som verkligen är sjukda.
Nackdel
- lägre specificitet och sensitivitet jämfört PCR
- Risk för falsk pos och neg svar
Genompåvining
- fördelar
- obs! vid diagnostik?
- Vad är kvantitativ PCR? Beskriv ct-värde och övergripligt hur man gör en kvantitativ PCR.
Fördelar
- Hög sensitivitet och specificitet
- snabbt
- billigt
- Högt negativt prediktivt värde = dem som är friska som testas är sant negativa
Man ska observera att risk för kontamination av DNA eller RNA kan finnas. Viktigt att hantera provet rätt. Mutationer mellan olika virusstammar kan också störa analysen.
Kvantitativ PCR = mäta antalet av en mikroorganism i ett prov.
1. man adderar till primer en prob som är fluorescerande. Fluorescens avläses i optiskt instrument. Ju mer fluorescens, desto fler DNA/RNA fanns i provet från början.
- ct-värde (cycle treshold) fås när fluorescens är mätbar. lågt ct-värde = mycket virus. Högt ct-värde = lite virus.
- Kvantifiering - Genom att använda kända spädningar av fluorescens med viruskopior kan man beräkna hur många virus som fanns i provet från början innan k
När använder man kvantitativ PCR? (antal virus per volymsenhet)
- bedöma transplanterade patienter - hur aggressiv ett virus är
- följa behandling - t.ex. HIV eller hepatit.
- avgöra smittsamhet
- MEN- ofta är inte kvantifiering viktigast. Man svarar ofta ut med POS eller NEG endast, för att veta om man är infekterad av ett virus.
Beskriv kortfattat metoden PCR
- cykler
- vad använder man för protein om man ska göra PCR på RNA som måste finnas?
Innan PCR lyseras partiklarna. Nueklaser i partikeln frisätts för att, man tvättar då bort dessa först innan dem har skadat DNA eller RNA
En cykel
- 2 Primers riktad mot specifik sekvens av DNA eller RNA som mikroorganismen har. T.ex. virus. Riktad åt sens och antisens sträng.
- Upphettning 90 grader - dsDNA denaturerar till enkelsträngar - Temp sänks till 70 grader. primers hybridiserar till sin specifika sekvens
- Temp sänks till 60 grader. DNA eller RNA polymeras börjar amplifiera. Nukleotider tillsätts.
RNA-virus
- Reverse transkriptas används först för att få DNA, så att primers kan binda in.
Vad är snabb PCR?
- hur snabbt fås resultat?
En automaticerad metod av PCR där extrahering och amplifiering av sökt DNA eller RNA finns. Man har paneler med olika primers. Resultat inom 1 timme.
Efter PCR kan man typa och sekvensera.
- vad innebär det och varför gör man det?
- vad är positivt med NGS framför Sangersekvensefing?
PCR produkten kan sekvenseras för att bestämma
- resistensgener för antiviral behandling
- skilja på olika virusstammar
- smittspåra (specifik stam)
- Sangersekvensering används mest. Negativt - man kan inte påvisa alla mutationer. NGS - effektivt och kan påvisa mindre mutationer.
Den indirekta metoden antikroppspåvisning
- när är detta lämpligt att utföra?
Vad är nackdelarna med Serologi vid virusdiagnostik?
- vad är skillnaden på IgM och IgG i tid när man kan påvisa dessa.
IgM kan påvisas 5-10 dagar efter infektion. Kan kvarstå upp till 1 år. Svag reaktion - dålig specificitet.
IgG tar längre tid - 1-6 veckor att vildas. Förutom EBV. IgG kvarstår flera år - livslångt.
Beskriv kort hur IgM och IgG ser ut i blodet i koncentration vid
- primär infektion
- reaktivering eller reinfektion av virus
Det finns 3 metoder för att påvivisa antikroppar på labbet. Den vanligaste är ELISA, samma metod som antigenpåvisning.
- beskriv metoden.
- Flera antigen kan testas för om man har antikroppar på en gång - flera brunnar med olika antigen
- fotospektrometri görs ofta automaticerat i fotometer
Immunoblotting är en metod för att påvisa antikroppar.
- beskriv stegvis metoden.
- vad är fördelen med detta?
- Man sönderdelar enskilda proteiner av ett virus. Separeras med elektrofores efter vikt.
- Man får därmed enskilda virala antigen som visas på färgade band.
- Hög specificiet.
- Används t.ex. för att konfirmera HIV, efter ett snabbtest av HIV.
Neutralisation (för att se om man har neutraliserande antikroppar) är en metod man kan använda för att påvisa antikroppar. Men den används sällan.
- beskriv metoden stegvis
- vilka nackdelar har den?
Man bedömer visuellt om cellerna oskadliggörs, med hjälp av antikroppar.
- Man använder olika spädningar av serum för att bestämma lägsta koncentration som kan neutralisera viruset (titer)
Används i specialfall t.ex. för att undersöka immunitet.
