Virologisk molekylär diagnostik Flashcards
Vad är traditionell virusdiagnostik ?
- virusodling
- antikroppar
- påvisning via elektronmikroskop
Vad är herpes virus (HSV) och vad är varicella-zostervirus (ZVZ)
- > Finns herpes virus 1 och 2. Orsakar blåsor runt munnne (munsår)
- > ZVZ virus orsakar bla. vatten koppor som orsakar blåsor runt om på kroppen
Vad är Cytomegalovirus (CMV) ?
- kan ge körtelfeber på immunkompetenta
- kan allvarlig sjd hos transplanterade och andra immunsupprimerade. Så som feber, hepatit eller colit.
Vad är Epstein-barrvirus (EBV)?
- körtelfeber hos immunkompetenta
- feber, hepatit och PTLD hos immunsupprimerade
- kvantifiering av EBV-DNA i blodet.
Vad är hepatit- C virus (HCV)
> > Kan orsaka kronisk inflammation, skrumplever och levercancer
Genotypning före behandling
HCV-RNA-analys för att bedöma behandlingseffekt
Vad är hepatit-B virus (HBV)
> > Kan orsaka kronisk inflammation, skrumplever och levercancer
HBV-DNA-kvantifiering för att bedöma prognos eller levercancer
Genotypning inför behandling
Sekvensering – molekylär epidemiologi
Vanliga luftvägsinfektioner ?
- Rhinovirus = 40-50%
- coronavirus = 15%
- Influensa A och B = 5-10%
Vad finns det för gastroenteriter ?
- > virus: rotavirus, calici virus, adeno virus, astrovirus
- > Bakterier: Shigella, Salmonella, V cholerae.
- > Protozoer: Cryptosporidium, Giardia
Vad är HPV (humant papillomvirus) ?
- 100 kända subtyper- 30 genitala subtyper
- 14 subtyper associerade :ll livmoderhalscancer (cervixcancer)
- > HPV testning införs om primärscreening 2019
Vad har PCR för svagheter?
- Specificiteten osäker
- Specificiteten osäker
- Kontamina,onsrisk
- Kvan,fiering krånglig och inexakt
Vad finns det för fördelar med realtids PCR?
- Hög specificitet = prober ger 100% säkerhet
- Hög sensi,vitet
- snabb
- Minskad kontaminationsrisk
- Möjligt att kvantifiera och typa
- Utveckling/optimering av PCR
Vad är Taqman-probe (hydrolysprobe)?
- Fluorescensen låg om proben är intakt
- Binder till utvidgade fragment
- Bryts ner av polymeraset: = fluoroscens
Hur fungerar kvantifiering av..
- Ct-värdet för varje prov ?
- Ct-värdet för co-amplifierat ?
> > Ct-värdet för varje prov relateras till en standardkurva. Denna kurva utgår efter seriespädning av kända koncetrationer.
Ct-värdet för co-amplifierat DNA/RNA är relativ kvantifiering, skillnad i Ct-värdena
Vad innebär typning ?
- Om en probe inte passar perfekt blir bindningen och fluorescensen svag.
(Flera prober mot samma område –> typning) - Om en primer inte passar i 3-ändan blir amplifieringen dålig
(primrar med olikheter i 3-> typning
Hur fungerar digital PCR?
- Provet späds och fördelas på många PCR-reaktioner.
- 20,000 taqman-reak,oner à 1 nL
- Varje reak,on avläses + eller –
- Kan göras i emulsion eller chip
- baserat på relationen +/- reaktioner kan koncentrationen beräknas.
Varför ska man använda sig av digital PCR?
- Absolut kvantifiering med högre precision
- Påvisa fraktioner med resistensmutationer
- Kvantifiera standarder
- Forskning
Vad innebär en sekvensering ?
- Identifiering av virus och bakterier
- Genotypning
- Molekylär epidemiologi (smittspårning, analys av epidemier)
- Resistensmutationer (HIV, HBV, HCV)
Vad innebär Kedjestoppssekvensering (Sanger) ?
- Oftast PCR först
- Ibland kloning
- ”Cycle sequencing” för att skapa alla längder (stoppnukleotider)
- Avläsning med elektrofores
Hur är arbetsflödet av sangerssekvensering?
- PCR, kolla band
- (rening)
- Cyklisk sekvensering, kolla band
- (rening)
- Läsning i instrument
- Visuell koll av sekvensen, redigering, tolkning
Vad har sangerssekvensering för begränsningar ?
- Svårt om koncentra,onen är låg eller om virus är mycket variabelt (svagt eller inget band)
- Annat DNA kan ha amplifierats, vilket ger ett brus med extrakurvor i krommatogrammet.
- Tidskrävande om man vill ha hela virus, nästan omöjligt a] få humant genom
Vad påverkas selektion av?
- Genetisk barriär
- Fitness: (Hur väl kan muterat virus replikera? )
- Kompensatoriska mutationer (Kan fitness förbättras genom andra mutationer? )
Varför gör vi smittspårning?
- Källan till ett utbrott (livsmedel, vatten)
- smittkedjor
- enskilt fall (sexuell överföring)
Vad innebär fylogeni?
- olika slags träd?
- > jämförelse av sekvenser för att försöka förstå hur det utvecklas.
- > finns olika matematiska modeller
- > fylogenetiskt träd finns två sorter: rotat och orotat
Vad innebär “reads” som bildas vid MPS/NGS körning?
- varje körning ger massor av “reads”, alltså avlästa sekvenser som är 200-400nt.
- Dessa reads jämförs med varandra och ofta med referenssekvenser för att fogas samman.
- Varje position finns ofta i många reads. Detta “djup” påverkar hur säkert positionen kan bedömas.
