Cellanalys för immundiagnostik

Question 1

Vad är primär immunbristsjukdom ?

Answer 1

medfödd genetisk sjukdom orsakad av att någon

komponent i immunsystemet saknas/inte fungerar

Question 2

Vad är sekundär immunbristsjukdom ?

Answer 2

Sekundär immunbristsjukdom – immunbristsjukdom som förvärvats under livet
Exempel: AIDS, immunbrist vid cellgiftsbehandling

Question 3

Vad är autoimmun sjukdom ?

Answer 3

Autoimmun sjukdom – sjukdom som orsakas av att immunsystemet aktiveras av och reagerar mot kroppens egna molekyler (självantigener = autoantigener)

Exempel: MS, ledgångsreumatism, Graves sjukdom, SLE

Question 4

Vad är allergier?

Answer 4

Allergi – tillstånd orsakat av att immunsystemet aktiveras av och reagerar mot ofarliga
molekyler i omgivningen eller födan (allergener)

Exempel: nässelutslag, hösnuva

Question 5

Vad används immunoassay till?

Answer 5

En immunoassay är en laboratoriemetod som används för att detektera
eller kvantifiera en molekyl med hjälp av den specifika bindningen mellan
antikropp och antigen.

Question 6

Varför används cellanalyser ?

Answer 6

Cellanalyser används ffa för diagnos av immunbristtillstånd och uppföljning av patienter som genomgår immunterapi, men även för diagnostik av överaktivitet i immunsystemet
(autoimmunitet, allergi)

Question 7

Vilka prover görs på cellanalys? Hur fungerar dess metod?

Answer 7

• Immunceller analyseras ffa i blodprover, men ibland även i andra typer av prover, såsom CSF, BAL och vävnadsextrakt.
• Ofta separeras immuncellerna från röda blodkroppar före analys.
• Separation sker genom tex:
- densitetsgradientcentrifugering (mha lymfoprep/ficoll)
- osmotisk lysering av röda blodkroppar (tex mha ammoniumklorid)

Question 8

Vad innebär isolering av celler? Varför görs detta?

Answer 8

• För vissa analyser krävs rena cellpopulationer, tex T-celler, B-celler eller monocyter.
• Olika celltyper kan isoleras mha monoklonala antikroppar mot unika cellytemolekyler som
uttrycks av respektive celltyp.
Exempel:
T-celler – anti-CD3 antikropp
B-celler – anti-CD19 eller CD20 antikroppar
Monocyter – anti-CD14 antikropp
• Om de monoklonala antikropparna är märkta med fluorokromer kan cellerna isoleras
mha flödescytometri

Question 9

Finns olika typer av cellanalys vilka?

Answer 9

• Fenotypiska cellanalyser

- Funktionella cellanalyser

Question 10

Krävs oftast att immunocellerna aktiveras i provröret, hur aktiveras immuncellerna? Å

Answer 10

• Monocyter/makrofager – TLR-ligander, tex LPS, CpG DNA
• B-celler – lektiner (PWM etc), Epstein-Barr Virus (EBV)
• T-celler – lektiner (PHA etc), anti-CD3-antikroppar

Question 11

Hur fungerar ELISA ? Hur kan ELISA användas ?

Answer 11

• ELISPOT baseras på samma princip som Sandwich-ELISA, men istället för att
mäta absorbans i en lösning räknas färgprickar (spots) på ett membran.
• Metoden kan användas för att anlysera förmågan hos celler att producera ett
visst protein.

• En spot på membranet = en cell som producerar det eftersökta proteinet

Question 12

Vad gör ELISPOT

Answer 12

• Analys av antikroppsproducerande celler

Question 13

Ge exempel på ELISPOT ANALYS som skulle kunna hända

Answer 13

• Analys av antal B-celler i ett prov som producerar IgG, IgA eller IgM för diagnostik
av patienter med B-cellsdefekter - Plattor coatade med anti-IgG/A/M antikroppar

• Analys av antal B-celler i ett prov som producerar IgG/A/M-antikroppar specifika
för mikroorganism eller vaccin (tex stelkrampstoxoid) för diagnostik av patienter
med B-cellsdefekter - Plattor coatade med vaccinantigen

Question 14

Hur diagnosticeras T-cellsdefekter ?

Answer 14

• För att diagnosticera T-cellsdefekter kan T-celler stimuleras med antigen
eller substans som aktiverar många T-celler och celldelningen kan mätas
mha inkorporering av radioaktivt tymidin i DNA

Question 15

Vad är flödescytometri

Answer 15

• Automatiserad analys av flera egenskaper samtidigt hos enskilda celler/partiklar i
vätskelösning. Ex: Immunceller, plastkulor, bakterier.

• Mycket användbar metod för att kunna särskilja olika immunceller från varandra och för
att studera deras egenskaper och funktion.

• Flödescytometri kan användas både för att analysera (vanligast) och sortera celler och
partiklar.

• Inom klinisk immunologi används flödescytometri ffa för analys av immunceller men även
för koncentrationsbestämning av proteiner i lösning (mha beadbaserad flödescytometrisk
multiplexanalys)

Question 16

Ge exempel på flödescytrometriska analyser ?

Answer 16

• Celldelning
• Cellviabilitet
• Apoptos
• Intracellulära signalproteiner
• Cytotoxicitet

Question 17

Vad gör en fluorokrom?

Answer 17

• Olika fluorokromer absorberar och emitterar ljus i olika våglängder.
Emissionsspektrum
• Det finns idag ett mycket stort antal fluorokromer kopplade till olika monoklonala
antikroppar.

Question 18

Varför är det bra att används flera antikroppar märkta med fluorokromer ?

Answer 18

Använd flera olika antikroppar märkta med olika fluorokromer samtidigt – gör det möjligt
att analysera olika celltyper och deras funktion samtidigt.

Question 19

Vad finns det för markörer ?

Answer 19

• utmarkörer
• intracellulära markörer
• blandning mellan ovanstående

Question 20

Hur fungerar flödescytometrins arbetsflöde ?

Answer 20

1. Använder hel blod eller PBMCs
   Cellerna separerar
2. Specifika fluorokrommärkta antikroppar (ev. Lysering av röda blodkroppar)
   -> För intracellulär färgning måste cellmembranet
   permeabiliseras med detergent
3. Analys fullbordas och ett resultat konstateras

Question 21

Utveckling inom flödescytometrin?

Answer 21

Fler färger (2->18 ->48), högre hastighet, högre känslighet

Question 22

Vad har flödescytometern för delar ?

Answer 22

1. Flödessystem – för provet genom maskinen i vätskeström
2. Optik – exciterar flurokromer (laser) och samlar in ljus
   (detektorer)
3. Elektronik – omvandlar ljus till digital information och
   siffror

Question 23

Vad mäter flödescytometrin ?

Answer 23

• Forward scatter (FSC) light – reflekterar storlek hos cellen
• Side scatter (SSC) light – reflekterar granularitet hos cellen
• Fluorescensintensitet – reflekterar hur många fluorokrommärkta antikroppar som
bundit till cellen

Question 24

Hur fungerar elektroniken ? Vad omvandlas den till? P

Answer 24

• Elektroniken omvandlar ljus till en elektrisk puls och digitala värden som kan analyseras
mha dator.
varje cell genererar en elektrisk punkt

Question 25

Ge exempel på flödescytrometriska metoder ,..

Answer 25

Cellanalyser:
• Analys av frekvens och antal hjälpar T-celler
• Analys av fagocytfunktion
• Analys av intracellulär cytokinproduktion
Analys av proteiner i lösning:
• Analys av cytokiner utsöndrade från aktiverade T-celler (kulbaserad
flödescytometrisk multiplexanalys)

Question 26

Hur fungera flödescytometrin vid analys av hjälpar T-celler ?

Answer 26

• För att bestämma antalet T-
celler/volymsenhet blod tillsätts en känd
mängd plastkulor till en känd provvolym.
• Antalet kulor som detekteras räknas och
används för att beräkna den analyserade
provvolymen.
• Antalet detekterade T-celler räknas och
relateras till provvolymen.

Question 27

När görs Fagocytfunktionstester?

Answer 27

• Fagocytfunktionstester utförs vid utredning av immunbristtillstånd.
• Monocyter och neutrofiler fagocyterar och bryter ned mikroorganismer mha enzymer och
reaktiva syreradikaler.

Question 28

Vad är Kulbaserad flödescytometrisk multiplexanalys av cytokiner

Answer 28

• Cytokinproduktion från aktiverade T-celler kan också analyseras genom att detektera
utsöndrade cytokiner i cellodlingsmediet mha kulbaserade flödescytometrisk
multiplexanalys.

• Captureantikroppar specifika för cytokiner fästs till plastkulor (beads)
• Kulorna är färgade med en eller flera fluorescerande färger
• En typ av kula coatas med antikroppar som känner igen en typ av cytokin
• Detektionsantikropparna är märkta med fluorokromer
• Analysen baseras på flödescytometrisk detektion av fluorescenssignal från kulor +
  detektionsantikroppar

Question 29

Hur fungerar flödescytometrisk cellsortering ?

Answer 29

• Flödescytometi kan även användas för att isolera olika cellpopulationer från en komplex
blandning av celler.
• Cellerna placeras då i olika vätskedroppar (en cell/droppe) som får olika laddning
beroende på vilka fluorokromer som detekteras på cellen.
• Dropparna med celler sorteras mha elektromagneter.