Cellanalys för immundiagnostik Flashcards
Vad är primär immunbristsjukdom ?
medfödd genetisk sjukdom orsakad av att någon
komponent i immunsystemet saknas/inte fungerar
Vad är sekundär immunbristsjukdom ?
Sekundär immunbristsjukdom – immunbristsjukdom som förvärvats under livet
Exempel: AIDS, immunbrist vid cellgiftsbehandling
Vad är autoimmun sjukdom ?
Autoimmun sjukdom – sjukdom som orsakas av att immunsystemet aktiveras av och reagerar mot kroppens egna molekyler (självantigener = autoantigener)
Exempel: MS, ledgångsreumatism, Graves sjukdom, SLE
Vad är allergier?
Allergi – tillstånd orsakat av att immunsystemet aktiveras av och reagerar mot ofarliga
molekyler i omgivningen eller födan (allergener)
Exempel: nässelutslag, hösnuva
Vad används immunoassay till?
En immunoassay är en laboratoriemetod som används för att detektera
eller kvantifiera en molekyl med hjälp av den specifika bindningen mellan
antikropp och antigen.
Varför används cellanalyser ?
Cellanalyser används ffa för diagnos av immunbristtillstånd och uppföljning av patienter som genomgår immunterapi, men även för diagnostik av överaktivitet i immunsystemet
(autoimmunitet, allergi)
Vilka prover görs på cellanalys? Hur fungerar dess metod?
• Immunceller analyseras ffa i blodprover, men ibland även i andra typer av prover, såsom CSF, BAL och vävnadsextrakt.
• Ofta separeras immuncellerna från röda blodkroppar före analys.
• Separation sker genom tex:
- densitetsgradientcentrifugering (mha lymfoprep/ficoll)
- osmotisk lysering av röda blodkroppar (tex mha ammoniumklorid)
Vad innebär isolering av celler? Varför görs detta?
• För vissa analyser krävs rena cellpopulationer, tex T-celler, B-celler eller monocyter.
• Olika celltyper kan isoleras mha monoklonala antikroppar mot unika cellytemolekyler som
uttrycks av respektive celltyp.
Exempel:
T-celler – anti-CD3 antikropp
B-celler – anti-CD19 eller CD20 antikroppar
Monocyter – anti-CD14 antikropp
• Om de monoklonala antikropparna är märkta med fluorokromer kan cellerna isoleras
mha flödescytometri
Finns olika typer av cellanalys vilka?
- Fenotypiska cellanalyser
- Funktionella cellanalyser
Krävs oftast att immunocellerna aktiveras i provröret, hur aktiveras immuncellerna? Å
- Monocyter/makrofager – TLR-ligander, tex LPS, CpG DNA
- B-celler – lektiner (PWM etc), Epstein-Barr Virus (EBV)
- T-celler – lektiner (PHA etc), anti-CD3-antikroppar
Hur fungerar ELISA ? Hur kan ELISA användas ?
• ELISPOT baseras på samma princip som Sandwich-ELISA, men istället för att
mäta absorbans i en lösning räknas färgprickar (spots) på ett membran.
• Metoden kan användas för att anlysera förmågan hos celler att producera ett
visst protein.
• En spot på membranet = en cell som producerar det eftersökta proteinet
Vad gör ELISPOT
- Analys av antikroppsproducerande celler
Ge exempel på ELISPOT ANALYS som skulle kunna hända
• Analys av antal B-celler i ett prov som producerar IgG, IgA eller IgM för diagnostik
av patienter med B-cellsdefekter - Plattor coatade med anti-IgG/A/M antikroppar
• Analys av antal B-celler i ett prov som producerar IgG/A/M-antikroppar specifika
för mikroorganism eller vaccin (tex stelkrampstoxoid) för diagnostik av patienter
med B-cellsdefekter - Plattor coatade med vaccinantigen
Hur diagnosticeras T-cellsdefekter ?
• För att diagnosticera T-cellsdefekter kan T-celler stimuleras med antigen
eller substans som aktiverar många T-celler och celldelningen kan mätas
mha inkorporering av radioaktivt tymidin i DNA
Vad är flödescytometri
• Automatiserad analys av flera egenskaper samtidigt hos enskilda celler/partiklar i
vätskelösning. Ex: Immunceller, plastkulor, bakterier.
• Mycket användbar metod för att kunna särskilja olika immunceller från varandra och för
att studera deras egenskaper och funktion.
• Flödescytometri kan användas både för att analysera (vanligast) och sortera celler och
partiklar.
• Inom klinisk immunologi används flödescytometri ffa för analys av immunceller men även
för koncentrationsbestämning av proteiner i lösning (mha beadbaserad flödescytometrisk
multiplexanalys)
Ge exempel på flödescytrometriska analyser ?
- Celldelning
- Cellviabilitet
- Apoptos
- Intracellulära signalproteiner
- Cytotoxicitet
Vad gör en fluorokrom?
• Olika fluorokromer absorberar och emitterar ljus i olika våglängder.
Emissionsspektrum
• Det finns idag ett mycket stort antal fluorokromer kopplade till olika monoklonala
antikroppar.
Varför är det bra att används flera antikroppar märkta med fluorokromer ?
Använd flera olika antikroppar märkta med olika fluorokromer samtidigt – gör det möjligt
att analysera olika celltyper och deras funktion samtidigt.
Vad finns det för markörer ?
- utmarkörer
- intracellulära markörer
- blandning mellan ovanstående
Hur fungerar flödescytometrins arbetsflöde ?
- Använder hel blod eller PBMCs
Cellerna separerar - Specifika fluorokrommärkta antikroppar (ev. Lysering av röda blodkroppar)
-> För intracellulär färgning måste cellmembranet
permeabiliseras med detergent - Analys fullbordas och ett resultat konstateras
Utveckling inom flödescytometrin?
Fler färger (2->18 ->48), högre hastighet, högre känslighet
Vad har flödescytometern för delar ?
- Flödessystem – för provet genom maskinen i vätskeström
- Optik – exciterar flurokromer (laser) och samlar in ljus
(detektorer) - Elektronik – omvandlar ljus till digital information och
siffror
Vad mäter flödescytometrin ?
• Forward scatter (FSC) light – reflekterar storlek hos cellen
• Side scatter (SSC) light – reflekterar granularitet hos cellen
• Fluorescensintensitet – reflekterar hur många fluorokrommärkta antikroppar som
bundit till cellen
Hur fungerar elektroniken ? Vad omvandlas den till? P
• Elektroniken omvandlar ljus till en elektrisk puls och digitala värden som kan analyseras
mha dator.
varje cell genererar en elektrisk punkt
