FACS Genomgång Flashcards
Vad innebär mätning av forward scatter?
Under en mätning av forward scatter mäts cellens storlek.
Det fungerar genom att ljuset strålar emot cellen och kommer brytas snett framåt olika mycket beroende vilken cell som åker igenom ljust.
Vad innebär mätning av side scatter ?
Mätning görs för att få fram hur mycket granula och vesiklar som finns i cellen?
Det fungera genom att ljuset reflekteras mot cellen och beroende på hur mycket cellens ljus som sprids åt sidan kan de avgöra hur mycket granula och vesiklar somm finns.
Vad är fluorescens ?
Det är en process som orsakar en excitation av en molekyl eller atom.
Ämnet som belyses av ljuset kommer absorberas upp av ämnets valenselektroner och därmed exciteras ämnet.
Excitation processen leder till högre energiläge för elektronerna.
För varje ämne är excitations processen speciell
Vad är autofluorescens ? Vilka blodceller är mest autofluorescensa?
Det är cellens naturliga fluorescens
Naturligt har cellen ett flertal ämnen i sig, dessa ämnen år autofluorescensen beroende utav.
I de allra flesta fall använda autofluorescensen för infärgning för celler för att granska celltypen .
Monocyter och neutrofiler är dem som är mest autofluorescens. Lymfocyter är minst
Hur vet vi att de är positivt / negativt resultat ?
Lösning:
-> FMO = fluorescense minus one (alla antikroppar utom en i ett kontrollprov, kan därav kontrollera mer)—> ta med ofärgade
celler (FMO) för att veta
vad som är negativt resp
positivt.
-> Isotypkontroller
-> Ostimulerade prover
Vad gör man åt ospecifik inbindning ?
•Fc-receptorer
• Lösning: blocka med serum från samma
organism som de celler man färgar in för att
mätta Fc-receptorerna
• en ospecifik inbindning skulle leda till mycket konstiga värden
Vad gör man åt döda celler i provet ?
Lösning:
Färga in döda celler så att man kan
selektera bort dem. Det finns olika ”dead-stains” som tar sig in i döda celler och binder
till t ex DNAt eller fria aminer.
Vad ska man göra vid dubbletter? Vad är viktigt att hålla koll på?
- Dubbletter i ett prov innebär att de bildats en cellklump och denna klump har räknats till som en hel cell.
- viktigt att hålla koll på area och höjd. Att den är detsamma i varje prov.
- Lösning: använd FSC-area mot FSC-height för att
selektera bort celler med avvikande area.
Vad är Spectral overlap? Lösning på dettav
– När våglängden hos de emitterade fluorokromerna
överlappar och läcker in i varandra.
– Ger falska värden
Lösning
– Välja fluorokromer som inte
överlappar
– Kompensation
Vad har FACS (flödescytometri) för analysprincip ?
Tekniken går ut på att celler passerar en och en genom en liten kanal där de belyses av en laserstråle, varpå reflekterat och avböjt laserljus mäts. Det reflekterade ljuset är ett mått på hur mycket granula som finns i cellen och det avböjda ljuset är ett mått på hur stor cellen är. Med dessa två enkla variabler kan man enkelt dela upp cellerna i blodet i röda blodkroppar, blodplättar och olika grupper av vita blodkroppar.
Inom avancerad flödescytometri kan man sätta till antikroppar som binder till specifika proteiner, eller sådana ämnen som binder in till DNA. Dessa antikroppar och ämnen kan också mätas i laserljuset, och då kan mängden av ett visst protein eller mängden DNA uppskattas. Avancerade instrument kan ha flera olika lasrar och mäta många parametrar samtidigt.
