Analys av antikroppar och antigen för immunodiagnostik Flashcards
Vad finns det för immunologiska metoder som används inom klinisk immunologi ?
- Detektion med hjälp av synen: agglutination och precipitation
- Detektion med hjälp av maskin/apparat: ELISA eller ELISA SPOT, FACS och CLIA
Hur fungerar metoder för immunbrist/transplantation ?
- Mäta totalmängd antikroppar IgG, IgM eller IgA
- Mäta koncentration av komplementfaktorer
- mäta cytokiner
- Ex. ELISA eller flödescytometri
Hur fungerar metoden för autoimmunitet ?
- Mäta mängden specifika antikroppar som binder till självantigen
- EX. är immunofluorscens eller ELISA
Hur fungerar metoder för allergi och överkänslighet ?
- Mäta mängden antikroppar som binder till allergen
- ImmunoCap (typ ELISA)
Vad är Agglutination och precipitation?
Agglutination:
antikroppsmediernad ihopklumpning av olösliga partiklar såsom bakterier, celler eller plaskulor täckta av antigener
Precipitation:
antikroppsmediard utfällning av lösliga molekyler
Vad kan antikroppar korsbinda? och vad behöver antikroppar och antigen?
- Antikroppar kan korsbinda partiklar och molekyler och skapa stora nätverk.
- Kräver att varje antigen och antikropp har mer än ett bindningsställe
- Nätverken kan vara synliga för blotta ögat.
Ge exempel på en agglutination ?
Exempel som hörts tidigare är blodgruppsbestämning, ABO.
• Antikroppar mot syfilisantigen på gelatinpartiklar mäts i en spädningsserie
Det finns olika agglutinations test, nämn två.
Direkt Coombs test = Direkt Antiglobulin Test (DAT)
-> Används tex vid misstanke om autoimmun hemolytisk anemi vid nyfödda banr
Indirekt Coombs test = Indirekt AntiglobulinTest (IAT)
-> Används för blodgruppering och korstest
Hur fungerar precipitation ?
- Antigenspecifik antikropp ingjuten i gel
- Antigen tillsatta i olika koncentrationer i brunnar i gelen
- När antigen diffunderar ut i gelen bildas en synlig utfällning
- Arean på utfällningscirkeln är proportionell mot antigenkoncentrationen i provet.
Vad används Dubbel Immunodiffusion (Ouchterlony) och hur fungerar det?
- Diagnostik av allergisk alveolit, en IgG-medierad sjukdom som främst uppstår vid upprepad inandning av organisk damm.
• Dubbel immunodiffusion är en semikvantitativ äldre metod som fortfarande används för att den är enkel och kan användas för att detektera antikroppar mot en stor mängd olika antigener. Ex: mögelantigen, antigen från fjädrar och avföring från fåglar etc.
• Om patienten har antikroppar mot allergenet bildas utfällnings reaktion som syns tydligt efter Coumassiefärgning av proteiner.
Vad gäller för antikroppar och antigen i en lösning vid maskinell undersökning ?
- Komplexbildning sker även om mängdförhållanden är långt ifrån ekvivalenszonen för precipitation.
- Vid en konstant antikroppskoncentration sker komplexbildningen snabbare ju högre koncentrationen är av antigenet (inom ett visst intervall)
- används ex vid kvantifiering av immunoglobuliner eller komplementfaktorer
Metoder som utförs av ljusspridning finns, vad innebär följande ljusspridnings metoder ?
- Turbidimetri
- Nefelometri
- > Nefelometri är ökning av ljusspridning per tidsenhet
- > Turbidimetri är minskning av ljusgenomsläpplighet per tidsenhet.
Vad utgår Solid phase immunoassays ifrån? Vilka metoder utgår från detta “sätt”
Immunoassays i vilka antigen eller antikropp är bunda till en fast fas såsom botten på en ELISA-platta eller en plastkula, medan de andra reaktanterna är fria i lösning.
- ELISA
- ELISA SPOT
- CLIA
- RIA
Vad kan den fasta fasen var i immunoassays ?
> > Fasta fasen kan vara en slät yta i en brunn på en 96 hålsplatta, ofta plast med kan även vara andra material
den fasta fasen kan också vara en kula, oftast i plast
Vad är sandwich ELISA? när används denna metod?
- standard metoden för analys av proteiner i vätska
- EX. mäta mängden IL-6 (cytokin) i vätska
Fördelar med metoden: - enkel metod - kräver endast spektrofotometer - resultat erhålls snabbt från relativt enkla program - relativt billig metod Nackdelar med metoden: - Analys av ett protein i taget - relativt tidskrävande - känslighet kan ibland vara för låg för att kunna detektera
Vad är ImmunoCap?
När används denna metod?
- ImmunoCAP är en ELISA-liknande automatiserad metod.
- Används för analys av allergenspecifika antikroppar (ffa IgE) för att diagnosticera allergier
- Allergiska (atopiska) individer producerar IgE mot allergerner tex pollen
- Analys av allergenspecifika IgE-antikroppar visar vilket allergen som patienter reagerar på.
- Den automatiserade ImmunoCAP-metoden underlättar analys av antikroppar mot många olika allergener
Hur laddar man en ImmunoCap maskin ?
- Maskinen programmeras vilka allergener respektive patientprov ska testas för
- Maskinen laddas med de Cappar som behövs.
- Maskinen parar själv ihop rätt prov med rätt Cap. Solida fasen bestå av en kula
- Ibland är kulan magnetisk och/eller färgad med en fluoroscerande färg för att underlätta tvätt och detektion
Flödescytometri
- vad liknar denna metod?
- Vad gör kulorna i metoden ?
Hydrodynamisk fokusering:
Celler/kulor passerar genom flödescellen och lasern en och en
- metoden liknar sandwhich ELISA
- Kulorna är färgade med en eller flera fluorescerande färger som ger en distinkt fluorescensmönster
- Detektionsantikropparna är (direkt eller indirekt) märkta med fluorokromer
- Analysen baseras på flödescytometrisk detektion från fluoroscenssignal från kulor
Vad finns det för Fördelar/nackdelar med kulbaserad flödescytometrisk?
Fördelar: - Möjligt att göra multiplexanalys av många proteiner samtidigt - sparar tid - sparar provvolym - ger relativt bred analysintervall Nackdelar: - Relativt hög analyskostnad per prov - kräver tillstånd till flödescytrometriska instrument - Kräver viss analysspecifik kunskap
Vad är metodprincipen för kulbaserad flödescytometri multikomplexanalys ?
• Multiplexanalysen baseras på detektion av kombination av minst två olika fluorescenssignaler:
- färgkodade kulor
- fluorokrom märkta specifika detektionsantikroppar
Specifika captureantikroppar är kopplade till kulorna:
Vad är det som ger möjlighet till multikomplex analys?
• Kulor med fluorescens i olika intensitet kopplas till olika detektionsantikroppar -ger möjlighet till att skapa multiplexanalys.
Vad har Luminex för analysprincip?
- Mha beads med olika klassifikationsfärger (CL) kan 50-500 olika proteiner analyseras samtidigt
- Det finns färdiga analyskit (säljs av flera olika företag) eller så kan man själv designa sig egen analyspanel
Vad betyder ANA?
- anti nuclear antibodies
- Antikroppar som bildas mot antigen(er) som finns i cellkärnorna
- ANA associeras med systemisk bindvävs- och autoimmuna sjd.
EX. sjögren eller SLE
Hur kan man analysera ANA med hjälp av flödescytometri?
- ANA screen: En helautomatiserad multiplexmetod för analys av autoantikroppar mot 13 olika kärnantigener mha magnetiska kulor – Luminexbaserad teknik
- Analysen är en screening-metod och positivt utfall verifieras med annan metod Ex, ELISA
