ELISA och CLIA Flashcards
Vad kan ELISA användas till?
Kan användas för att detektera både antigen och antikropp
EX. bestämning av serumantikroppar för HIV
Vid detektion av virusantigen tex, hepatit
mycket känslig metod
Vad använder man mest som antikroppar för ELISA ?
- Oftast används monoklonala antikroppar= specifika ak som binder till en del av antigenet
- Polyklonala antikroppar= mulitpla ak som binder till samma antigen
Finns olika varianter av ELISA vilka ?
- sandwich
- direkt
- indirekt
- kvalitativ /kvantitativ
Kort- Hur sker framställning av monoklonal antikropp?
B-cellshybridomen överlever i HAT medium, delar sig obegränsat och bildar antikroppar
Hur sker val av antigen ?
- > val av antigen tex. virus, proteiner, toxiner eller hormoner
- > kan vara antikroppar
Kortfattat hur sker ELISA metoden ?
- Coatning av platta (antigen/antikropp)
- Blockering
- Tillsättning av prov
- Detektionsantikropp
- Substrat
- Avläsning
Vad används för platta för ELISA metoden ?
- 96 hålls platta
- gjord av plast, som binder proteiner effektivt
Vad för Coatnings-buffert används ?
- Fosfatbuffert (PBS) eller karbonatbuffert
- Buffert som inte denaturerar antikropp/antigen, samtidigt som bindningen maximeras (oftast karbonatbuffert)
- pH är viktigt
Vad för blockering kan användas ?
Såsom= 1% PBS, 1% torrmjölk eller 10% kalvserum
Vilket steg är viktigt att göra efter blockering ?
- Tillsätt ev standard, kontroller + prover
- Vid antigenmätning är prover ofta supernatanter från cellodling, eller serum/plasma från patienter
Vad för spädning och kontroller används ?
- spädningen görs genom att späda i tween
- +/- kontroller
När används standard kurvan? Vad innehåller standard kurvan
- Används när antigenkoncentration ska mätas
(Sandwich- eller inhibitions-ELISA) - Seriespädning av en känd koncentration av
antigenet som ska mätas - Koncentrationen plottas mot absorbansen
Vad är detektionsantikropp?
- Vanligen konjugerad med ALP eller HRP
- Mus, råtta, kanin, get, får, häst
- Monoklonal eller polyklonal
- Koncentration antikropp
Ge ett exempel på detektions antikropp och hur den fungerar ?
- Avidin – kommer från ägg
- Avidin har väldigt hög affinitet för biotin (B
vitamin) - Detektionsantikroppen är konjugerad med
biotin - Enzymet är konjugerat med streptavidin
- Späd detektionsantikropp i blockeringslösning
med Tween
Vad är ELISA känsligheten beroende utav?
-> Känsligheten är beroende av vilket antikroppspar som används
-> Känslighet = den lägsta antigenkoncentrationen
som kan mätas, som ger högre absorbans än
negativ kontroll
Hur fungerar direkt ELISA ?
- Bindning av ak/ag direkt till botten i brunnen
- Märkt primärantikropp
- Substrat
Vad finns det för fördelad/nackdelar av direkt ELISA ?
Fördelar - snabb - liten risk för korsbindning Nackdelar - märkte primär ak - dyrt och tidskrävande - lägre flexibilitet
Hur fungerar indirekt ELISA ?
- Vanligen detektion av antikroppar
- Coatad med antigen i botten
- Prover innehållandes eventuella antikroppar
Vad finns det för fördelar/nackdelar med indirekt ELISA ?
Fördelar: - Stor variationsmöjlighet - Många kommersiella märkta sekundär ak tillgängliga - Ingen märkning av primärantikroppen Nackdelar: - Korsreaktioner kan förekomma - Extra inkubationssteg krävs
Hur fungerar sandwich ELISA ?
- Två olika antikroppar behövs
- Måste känna igen olika epitoper på antigenet
- Första antikroppen: “Capture Ab”
- Andra antikroppen: “Detektionsantikropp”
- Ofta: detektionsantikroppen är biotin-märkt
- Vanliga enzymer: HRP (Horse Radish
Peroxidase) och ALP
Hur fungerar kompetitiv ELISA ?
- Solid fas med ak
- Okänd mängd omärkt ag + känd mängd märkt ag
- Enzymaktivitet proportionell mot mängd bundet
märkt ag - Fördelar: vid komplexa mixer – kräver ej rening
- Nackdelar: varje ag kan kräva olika metoder
Vad kan det finnas för felkällor vid ELISA?
- Positiv- negativkontroll: otillräcklig tvättning,
- Negativ- positivkontroll: ej korrekt coating,
- Svag signal: ej riktig tvättning,
När använda dataanalys titer?
-> Titer används när man inte kan göra en koncentrationsbestämning (mätning
av specifika antikroppar)
-> Titer = Den inverterade spädningen där provet har högre signal än
bakgrunden
Vad finns det för alternativ metod till ELISA ?
CHEMILUMINESCENCE IMMUNOASSAY, CLIA • Mkt vanlig metod som alternativ till ELISA • Stora variationsmöjligheter • Hög känslighet • Snabb
