PCR och qPCR Flashcards
Vad står PCR för ?
Polymerase Chain Reaction,
Vad är PCR principen?
- Dela upp DNA-sträng
- Inbindning av primers
- DNA-syntes
- Exponentiell amplifiering
Vad behövs för komponenter i PCR ?
- DNA-samples
- primers
- max buffert
- tag polymerase
- PCR Tube
- nucleotides
Vad är det för extrationsmetoder som används ?
• Solid Phase
- Magnetkulor, silica, membran
- Manuellt (Kolonn) eller maskinellt
Vad måste DNA (eller RNA) templat var för att användas i PCR ?
Renad nukleinsyra fri från
inhibitorer som kan användas som
mall i PCR-reaktionen
Vad är viktigt att tänka på vid konstruktion av primers ?
Att tänka på när man konstruerar primers:
- GC innehållet (max 60%)
- Undvik långa sträckor av en enda nukleotid
- Tm-värdet (likvärdigt för FP och RP)
- Undvik att primrarna är komplementära med sig
själva eller med varandra
Vad är Tumregel för annealingtemperaturen?
Starta med en temperatur som är 5 grader lägre
än primrarnas smälttemperatur.
Vad är Oligonukleotider?
• Byggstenar
Deoxyribose nucleoside triphosphate
(dNTP)
Vad gör DNA polymeras?
Påskyndar sammanfogningen av dNTP
Vilka DNA polymeraser finns de?
-> Taq polymerase isolerades från den
värmeälskande bakterien Thermus aquaticus
-> Pfu polymeras isolerade från hypervärmeälskande
bakterie
-> sedan dess har man utvecklat dessa två genom genteknik
-> Skapat fusionspolymeras genom att inkorporera
valda delar från andra polymeras vilket har ökat
värmestabiliteten.
Vad är RT (Reverse transcriptase) -PCR?
• RNA omvandlas till cDNA med hjälp av enzymet reverse transcriptase • Specifika primers, oligo(dT)s, random primers • DNA-RNA hybrid • RNA bryts ned enzymatiskt • ssDNA komplementärt till det ursprungliga RNAt
Hur sker Detektion av det amplifierade
materialet?
• Gelelektrofores, agaros
• Infärgning av DNA
• EtidiumBromid, Gel Red,
Sybrgreen
Hur fungerar Nestad PCR?
• Primers innanför det första paret med primrar
• Ny PCR reaktion från produkten i den första PCR
reaktionen
• Ökad specificitet
• Kontaminationsrisk
Hur fungerar Realtids-PCR (qPCR)?
• Amplifieringen av DNA kan följas i realtid • Man “fångar” PCR- amplifieringen i den exponentiella fasen
Vad finns det för Skillnader mot ”vanlig” PCR jämfört med realtids
- Prober eller SYBR Green
- Detektion av amplifieringen i varje cykel
- Kvantitativ eller kvalitativ
- Slutet system
Vad är SYBR Green?
• DNA-bindande molekyler (Sybrgreen)
Hybridisation probes
Vad är Multiplex qPCR / RT-qPCR?
- Prober med olika fluoroscerande molekyler
* Flera primer/probe system i samma PCR-reaktion
Vad står q för i qPCR?
• Kvan4fiering med real4ds-PCR
-Rela4v eller Absolut
• Standardkurva
• Plasmid med känd koncentra4on i spädningsserie
Vilka problem skulle kunna uppstå ?
- Primer design
- Primerkoncentra3on
- Annealingtemperatur
- MgCl2 koncentra3on
- Sekundärstrukturer
Vad finns de för Fördelar qPCR?
- Högre specificitet (probe)
- Mindre risk för kontamination
- Möjlighet att kvantifiera
- ”Synlig” reaktion
- Tidseffektiv
Vad skulle man kunna utföra med PCR?
- Diagnostik av genetiska sjukdomar
- Fosterdiagnostik (cystisk fibros, Duchenne muscular dystrophy)
- Kontroll av bärare (Bröst cancer, Huntingtons sjukdom)
- Diagnostik av cancer sjukdomar (leukemi)
- Diagnostik av virussjukdomar
- Diagnostik av bakterieinfektioner (salmonella)
- Preimplantationsdiagnostisk vid provrörsbefruktning
- Rättsmedicin (faderskapsmål, brottsmål)
Vad är Digital droplet PCR (ddPCR)?
- Absolut kvantifiering (utan standardkurva)
- Upp till 96 prov per körning
- Prov, PCR reagens och olja blandas
- Droppar genereras
- 20 000 PCR-reaktioner per prov / en i varje droppe
- Dropparna fluorescerar och detta mäts i en flödescell
Vad är PCR analys princip?
- genom denna metod spårar man smittämnens arvsmassa.
- Genom att korta DNA (primers) Blandas dem med enzymer DNA-polymeras och nukleotider
- Om smittämnen finns i provet kommer dessa startaekvenser att fösta vid två punkter på smittämnets arvsmassa
- Startsekvenserna kommer sedan att fungera som start punkt för DNA-polymeraset som börjar kopierar DNA-strängen
- sedan skapas många kopior
- detektioner sker bland annat med hjälp av …
