Transcriptomique Flashcards
c’est quoi le transcriptome
l’ensemble de l’ARN
2 types de transcrits
ARN codant et ARN non codant
3 types d’ARN codant
ARNm, ARNt, ARNr
2 types d’ARN non codant
petit ARN non codant (microARN, ARN interférant) et long ARN non codant
utilité du séquencage de l’ARN (3)
1) Voir expression différentielle des gènes dans tissus/ temps donnée/condition spécifique
2) déterminer la structure transcriptionnelle des gènes (variant d’épissage)
3) détection de mutation/maladies génétiques
3 types de platformes de séquencage
1) séquencage de 1ere gen
2) séquencage à haut debit (next gen sequencing)
3) séquencage de 3eme génération
déroulement général du séquencage à haut débit (5 étapes)
1) isoler ARN à partir de cellules/tissu
2) enrichissement de l’ARN ciblé (ex:ajouter amorce polyT)
3) preparation de la librairie de séquencage
4) séquencage de la librairie avec platforme de séquencage
5)analyse et interpretation des données par bio-informatique
comment construire une librairie de séquencage
fragmenter l’ARN isolé, synthétiser ADNc par reverse transcription, amplification par PCR, ligature des adapteur de séquencage aux extrémités
séquencage de Sanger: nouvelle méthode vs vieille méthode
Nouvelle: on utilise un machine de séquencage qui a 4 différents fluorochromes pour identifier chacune des bases
Vieille:analyse de gel pour voir la séparation des bases et la séquence de l’ADN
c’est quoi le micropuces/microarray
technique pour évaluer l’expression d’un gène à différentes conditions àl’aide d’une petite lame qui contient des sondes complémentaires aux gènes spécifiques
6 étapes pour effectuer analyse avec micropuces
1) extraire ARN à partir de 2 tissus à diff. conditions
2) transcription inverse pour avoir ADNc
3) étiquetter chaque échantillon avec une sonde fluorescente de couleur différente
4) les 2 ADNc marqués sont mélangés et placés sur la micropuce
5)ADNc hybride avec les sondes dans les puits
6) lecture de la fluorescence et analyse
3 avantages pour la micropuce
1)peut détecter l’expression de milliers de gènes à la fois
2) peu couteux
3) technique simple
2 limitations pour la micropuce
1) il faut connaitre la séquence des gènes à l’avance
2) bruit de fond de l’hybridation peut affecter les resultats (besoin de bons contrôles pour chaque gène)
c’est quoi le séquencage illumina
méthode de next gen sequencing pour séquencage du génome entier/régions spécifiques. Il y a différentes machines pour le séquencage illumina
4 étapes pour le séquencage illumina
1) préparation des échantillons (librairie)
2) génération des grappes
3) séquencage
4) analyse des données
comment les échantillons sont préparés pour séquencage illumina (5 étapes)
1) fragmentation de l’ARN (200-500bp)
2) ajout des amorces
3) production de l’ADNc
4) ajout d’une base A
5) ajout des adaptateurs
c’est quoi l’étape de génération de grappes pour séquencage illumina
c’est quand l’ADNc est lié à la flow cell par les adaptateurs et forme un bridge pour generer un brin complementaire à l’ADNc (forme forward and reverse strand)
c’est quoi l’étape de séquencage par synthèse pour illumina (étape #3)
addition d’amorces et de ddNTPs avec fluorescence qui vont determiner la base
le nombre de cycles déterminer la longueur de la séquences
à chaque ajout de base, la lecture est effectuée et le cycle recommence pour la prochaine base
comment l’analyse de données est effectuée pour illumina
les données brutes sont placés dans système de bioinformatique et les séquences sont nettoyées et alignées à un transcriptome/génome de référence
3 avantages pour illumina
1) génère millions de lectures par essai
2) très précis (99,9%)
3) prix relativement bas
3 limitations pour illumina
1) protocole complexe (besoin d’une équipe spécialiée)
2) besoin de connaissances en bioinformatique
3) lecture petite (200-500bp)
c’est quoi l’ion torrent
une technologie qui utilise la détection des ions d’hydrogène générés lors de l’incorporation de nucléotides dans un brin d’ADN en cours de séquençage
6 étapes pour un séquencage avec ion torrent
1) synthèse d’ADNc et prep de librairie
2) PCR à émulsion (ePCR)
3) chargement de l’échantillon sur la puce
4) ajout d’un nucléotide à la fois
5) ion libéré entraine une modification du pH
6) détecter enregistre la changement du voltage pour chaque base ajoutée
2 avantages pour ion torrent
1) prix bas
2) essais rapides+automatisés
2 limitations pour ion torrent
1) taux d’erreur bigger than illumina
2) petite lecture (200-500bp)
5 avantages pour nanopore
1) peut faire longue lectures d’ARN ou ADN
2) peut séquencer ARN directement (pas besoin d’ADNc)
3) petite machine portable
4) peu couteux
5) pas besoin d’Amplification par PCR
1 limitation pour nanopore
taux d’erreur élevé (10-15%)
c’est quoi le single cell sequencing
avoir une cellule par puit, lyser la cellule pour avoir ARN
3 avantages pour single cell sequencing
1) classification des populations d’un même type de cellule
2) peut distinguer les population de cellules plus rares
3) comparaison des transcrits entre cellules individuelles
3 limitations pour single cell sequencing
1) prix élevé
2) basse efficacité
3) nombre limité d’échantillons (une cellule à la fois)
