Transcriptomique

Question 1

c’est quoi le transcriptome

Answer 1

l’ensemble de l’ARN

Question 2

2 types de transcrits

Answer 2

ARN codant et ARN non codant

Question 3

3 types d’ARN codant

Answer 3

ARNm, ARNt, ARNr

Question 4

2 types d’ARN non codant

Answer 4

petit ARN non codant (microARN, ARN interférant) et long ARN non codant

Question 5

utilité du séquencage de l’ARN (3)

Answer 5

1) Voir expression différentielle des gènes dans tissus/ temps donnée/condition spécifique
2) déterminer la structure transcriptionnelle des gènes (variant d’épissage)
3) détection de mutation/maladies génétiques

Question 6

3 types de platformes de séquencage

Answer 6

1) séquencage de 1ere gen
2) séquencage à haut debit (next gen sequencing)
3) séquencage de 3eme génération

Question 7

déroulement général du séquencage à haut débit (5 étapes)

Answer 7

1) isoler ARN à partir de cellules/tissu
2) enrichissement de l’ARN ciblé (ex:ajouter amorce polyT)
3) preparation de la librairie de séquencage
4) séquencage de la librairie avec platforme de séquencage
5)analyse et interpretation des données par bio-informatique

Question 8

comment construire une librairie de séquencage

Answer 8

fragmenter l’ARN isolé, synthétiser ADNc par reverse transcription, amplification par PCR, ligature des adapteur de séquencage aux extrémités

Question 9

séquencage de Sanger: nouvelle méthode vs vieille méthode

Answer 9

Nouvelle: on utilise un machine de séquencage qui a 4 différents fluorochromes pour identifier chacune des bases
Vieille:analyse de gel pour voir la séparation des bases et la séquence de l’ADN

Question 10

c’est quoi le micropuces/microarray

Answer 10

technique pour évaluer l’expression d’un gène à différentes conditions àl’aide d’une petite lame qui contient des sondes complémentaires aux gènes spécifiques

Question 11

6 étapes pour effectuer analyse avec micropuces

Answer 11

1) extraire ARN à partir de 2 tissus à diff. conditions
2) transcription inverse pour avoir ADNc
3) étiquetter chaque échantillon avec une sonde fluorescente de couleur différente
4) les 2 ADNc marqués sont mélangés et placés sur la micropuce
5)ADNc hybride avec les sondes dans les puits
6) lecture de la fluorescence et analyse

Question 12

3 avantages pour la micropuce

Answer 12

1)peut détecter l’expression de milliers de gènes à la fois
2) peu couteux
3) technique simple

Question 13

2 limitations pour la micropuce

Answer 13

1) il faut connaitre la séquence des gènes à l’avance
2) bruit de fond de l’hybridation peut affecter les resultats (besoin de bons contrôles pour chaque gène)

Question 14

c’est quoi le séquencage illumina

Answer 14

méthode de next gen sequencing pour séquencage du génome entier/régions spécifiques. Il y a différentes machines pour le séquencage illumina

Question 15

4 étapes pour le séquencage illumina

Answer 15

1) préparation des échantillons (librairie)
2) génération des grappes
3) séquencage
4) analyse des données

Question 16

comment les échantillons sont préparés pour séquencage illumina (5 étapes)

Answer 16

1) fragmentation de l’ARN (200-500bp)
2) ajout des amorces
3) production de l’ADNc
4) ajout d’une base A
5) ajout des adaptateurs

Question 17

c’est quoi l’étape de génération de grappes pour séquencage illumina

Answer 17

c’est quand l’ADNc est lié à la flow cell par les adaptateurs et forme un bridge pour generer un brin complementaire à l’ADNc (forme forward and reverse strand)

Question 18

c’est quoi l’étape de séquencage par synthèse pour illumina (étape #3)

Answer 18

addition d’amorces et de ddNTPs avec fluorescence qui vont determiner la base
le nombre de cycles déterminer la longueur de la séquences
à chaque ajout de base, la lecture est effectuée et le cycle recommence pour la prochaine base

Question 19

comment l’analyse de données est effectuée pour illumina

Answer 19

les données brutes sont placés dans système de bioinformatique et les séquences sont nettoyées et alignées à un transcriptome/génome de référence

Question 20

3 avantages pour illumina

Answer 20

1) génère millions de lectures par essai
2) très précis (99,9%)
3) prix relativement bas

Question 21

3 limitations pour illumina

Answer 21

1) protocole complexe (besoin d’une équipe spécialiée)
2) besoin de connaissances en bioinformatique
3) lecture petite (200-500bp)

Question 22

c’est quoi l’ion torrent

Answer 22

une technologie qui utilise la détection des ions d’hydrogène générés lors de l’incorporation de nucléotides dans un brin d’ADN en cours de séquençage

Question 23

6 étapes pour un séquencage avec ion torrent

Answer 23

1) synthèse d’ADNc et prep de librairie
2) PCR à émulsion (ePCR)
3) chargement de l’échantillon sur la puce
4) ajout d’un nucléotide à la fois
5) ion libéré entraine une modification du pH
6) détecter enregistre la changement du voltage pour chaque base ajoutée

Question 24

2 avantages pour ion torrent

Answer 24

1) prix bas
2) essais rapides+automatisés

Question 25

2 limitations pour ion torrent

Answer 25

1) taux d'erreur bigger than illumina 2) petite lecture (200-500bp)

Question 26

5 avantages pour nanopore

Answer 26

1) peut faire longue lectures d'ARN ou ADN 2) peut séquencer ARN directement (pas besoin d'ADNc) 3) petite machine portable 4) peu couteux 5) pas besoin d'Amplification par PCR

Question 27

1 limitation pour nanopore

Answer 27

taux d'erreur élevé (10-15%)

Question 28

c'est quoi le single cell sequencing

Answer 28

avoir une cellule par puit, lyser la cellule pour avoir ARN

Question 29

3 avantages pour single cell sequencing

Answer 29

1) classification des populations d'un même type de cellule 2) peut distinguer les population de cellules plus rares 3) comparaison des transcrits entre cellules individuelles

Question 30

3 limitations pour single cell sequencing

Answer 30

1) prix élevé 2) basse efficacité 3) nombre limité d'échantillons (une cellule à la fois)