Tema 24: Actividades de mantenimiento, gestión y operación en un laboratorio de cultivo celular. Flashcards
Reales decretos.
- RD 664/1997: sobre la protección de los trabajadores contra los riesgos relacionados con la exposición a agentes biológicos.
- RD 15/1994: régimen jurídico de la utilización confinada, liberación voluntaria y comercialización de organismos modificados geneticamente, a fin de prevenir riesgos para la salud humana y el medioambiente.
Agentes biológicos.
- Microorganismos con inclusión de los modificados genéticamente, cultivos celulares y endoparásitos humanos, susceptibles de originar cualquier infección, alergia o toxicidad.
Microorganismo.
- Toda entidad microbiológica, celular o no, capaz de reproducirse o de transferir material genético.
Cultivo celular.
El resultado del crecimiento in vitro de células obtenidas de organismos multicelulares.
Usos de cultivos celulares.
- se usan en investigación biomédica y en la industria biotecnológica.
- Producción de vacunas
- Ingeniería de proteínas
- Estudios de interacción y señalización celular.
- Ensayos de nuevos medicamentos.
Procedimiento de cultivo celular.
- Es el conjunto de técnicas que permiten el mantenimiento de las células in vitro preservando al máximo sus propiedades fisiológicas, bioquímicas y genéticas.
Tipos de cultivo celular primario.
- Cultivos en monocapa: las células crecen adheridas sobre un soporte sólido (plástico o vidrio). Es el método utilizado para la mayoría de las células excepto por ejemplo las células hematopoyéticas.
- Cultivos en suspensión: las células se encuentran suspendidas en el medio de cultivo. Es el tipo de cultivo de las células hematopoyéticas, algunas líneas celulares transformadas y células tumorales.
Línea celular.
En monocapa: separación de las células por métodos enzimáticos y se pasan a un nuevo frasco de cultivo.
- En suspensión: las células se diluyen en medio frasco.
Implicaciones de formación de una línea celular a partir de un cultivo primario.
- Aumenta el número de células obtenidas.
- Acaban predominando uno o dos tipos celulares, los que tienen mayor tasa de crecimiento.
- La población celular se hace uniforme y homogénea.
- Sus características se conservan durante las sucesivas generaciones y, si se conservan en nitrógeno líquido, de forma indefinida.
Vida de las líneas celulares.
- Vida finita: entre 20 y 100 generaciones.
- Superando este límite entran en la etapa de senescencia y pierden su capacidad de proliferar.
Células tumorales.
- No entran en senescencia: crecen indefinidamente.
- Pueden surgir de forma espontánea.
- Son el resultado de un cambio genotípico denominado transformación.
- Son inmortales: crecen indefinidamente.
- Su crecimiento es aberrante: se pierde la inhibición por contacto, la limitación de la densidad celular durante la proliferación y la dependencia del anclaje.
- Son malignas: invaden tejidos y dan lugar al crecimiento de tumores.
- Son genéticamente inestables: son heteroploides, varía el número de cromosomas (presentan aberraciones cromosómicas).
Operaciones de gestión de laboratorio de cultivo celular.
• Lavado, preparación y esterilización del material.
• Preparación y esterilización de medios de cultivo y reactivos.
• Mantenimiento y uso de los equipos del laboratorio (cabina de seguridad
biológica, incubadores, centrífugas, microscopios, dispositivos de pipeteo, etc.).
• Manipulación de los cultivos celulares.
Áreas de las instalaciones.
• Área de gestión de material usado (lavado de material sucio).
• Área de esterilización de material y reactivos (material limpio).
• Área o laboratorio de cultivos celulares donde se manipulan y mantienen los
cultivos en cabinas de flujo laminar e incubadores
Mantenimiento de la instrumentación y el equipamiento.
• Cabinas de seguridad biológica.
• Incubadores.
• Microscopios.
• Frigoríficos, congeladores y criogenizadores.
• Equipos de esterilización: autoclave y microfiltración.
• Otros instrumentos como centrífugas, contadores celulares, balanzas,
pipeteadores, etc.
Mantenimiento de los cultivos celulares.
• Es realizado por personal formado para trabajar en condiciones limpias y
estériles (indumentaria adecuada, etc.)
Nivel de Bioseguridad (NBS).
- En laboratorios con cultivos celulares se decidirá en función de una evaluación del riesgo.
- NBS 2 es el mínimo para el trabajo con cultivos celulares.
Cabinas de seguridad biológica (CSB).
- Equipos utilizados para mantener el
área en el que se manipulan los cultivos libre de posibles contaminantes, como
bacterias y levaduras, que puedan contaminar el cultivo. - Cabina proporciona flujo de aire filtrado con un filtro de alta eficiencia HEPA -> retiene partículas menores de 0.22 micrometros.
Incubadores de CO2.
- Son los equipos en los que se mantienen los cultivos celulares
pues proporcionan las condiciones idóneas para su mantenimiento en lo que se refiere a temperatura, humedad y porcentaje de CO2. - Valores más habituales:
· 37 ºC
· 95% de humedad
· 5% de CO2
Microscopio.
- Instrumento óptico que permite visualizar el cultivo y llevar así el
control morfológico de las células. - Más utilizados: microscopios invertidos con contraste de fases
· Fuente de iluminación y los objetivos se encuentran invertidos respecto a la platina de un microscopio óptico convencional
· Permite visualizar células que apenas tienen contraste aumentando la calidad de la imagen.
Frigoríficos, congeladores y criogenizadores.
• Neveras a 4 °C para el almacenamiento de medios, soluciones,…
• Congeladores a -20 °C para el almacenamiento de suero, antibióticos,
aminoácidos y soluciones enzimáticas (tripsina, colagenasa,…).
• Congeladores de -80 °C para el almacenamiento a largo plazo de los aditivos
del
• medio (suero, glutamina, antibióticos,…) y otros productos sensibles como
factores de crecimiento, mitógenos,…
• Instalación de nitrógeno líquido (-196 °C) para el almacenamiento a largo plazo
de las líneas celulares.
Equipos de esterilización: autoclave y microfiltración.
- Autoclave: recipiente metálico de paredes gruesas con un cierre hermético que permite trabajar a alta presión.
• Esterilización por calor húmedo: mediante el empleo de autoclaves que generan
vapor de agua (gran poder de penetración en los materiales) a alta temperatura
capaz de desnaturalizar las proteínas de los agentes biológicos -> para esterilizar cualquier material termorresistente (vidrio, metales, etc.).
• Esterilización por calor seco: mediante el uso de estufas u hornos Pasteur -> proporcionan altas temperaturas (sin utilizar vapor de agua: se requieren tiempos más elevados, tiene menor poder de penetración). Se emplea para materiales de vidrio.
• Esterilización mediante filtración. Se utilizan filtros de membrana de acetato de
celulosa con poros de 0.22 ó 0.1 micrometros de diámetro. Se emplea para esterilizar la mayor parte de los medios de cultivo, sueros y cualquier solución que contenga elementos termolábiles.
Procedimientos básicos de trabajo con cultivos celulares.
• Es conveniente descontaminar el área de trabajo y el material reutilizable antes y
después de trabajar con material biológico.
• Los cultivos se deben manipular en una CSB tipo II pues protege a la muestra, al
trabajador y al ambiente.
• Siempre se trabaja con material estéril (pipetas, tubos, botellas, medios, etc.).
• Es necesario identificar de forma adecuada los cultivos y todo el material biológico
que se encuentre dentro del laboratorio.
• Utilizar siempre equipos de protección individual (EPIs) como guantes y bata.
• Las manos deben lavarse antes y después de la manipulación de los cultivos
celulares.
• Siempre se debe descontaminar el material biológico antes de ser eliminado para
evitar su dispersión al medio ambiente:
· Los residuos líquidos se deben inactivar con un agente líquido descontaminante (lejía o similar).
· Los residuos sólidos pueden ser autoclavados y después ser eliminados como residuos convencionales.
