Tema 24: Actividades de mantenimiento, gestión y operación en un laboratorio de cultivo celular.

Question 1

Reales decretos.

Answer 1

• RD 664/1997: sobre la protección de los trabajadores contra los riesgos relacionados con la exposición a agentes biológicos.
• RD 15/1994: régimen jurídico de la utilización confinada, liberación voluntaria y comercialización de organismos modificados geneticamente, a fin de prevenir riesgos para la salud humana y el medioambiente.

Question 2

Agentes biológicos.

Answer 2

• Microorganismos con inclusión de los modificados genéticamente, cultivos celulares y endoparásitos humanos, susceptibles de originar cualquier infección, alergia o toxicidad.

Question 3

Microorganismo.

Answer 3

• Toda entidad microbiológica, celular o no, capaz de reproducirse o de transferir material genético.

Question 4

Cultivo celular.

Answer 4

El resultado del crecimiento in vitro de células obtenidas de organismos multicelulares.

Question 5

Usos de cultivos celulares.

Answer 5

• se usan en investigación biomédica y en la industria biotecnológica.
• Producción de vacunas
• Ingeniería de proteínas
• Estudios de interacción y señalización celular.
• Ensayos de nuevos medicamentos.

Question 6

Procedimiento de cultivo celular.

Answer 6

• Es el conjunto de técnicas que permiten el mantenimiento de las células in vitro preservando al máximo sus propiedades fisiológicas, bioquímicas y genéticas.

Question 7

Tipos de cultivo celular primario.

Answer 7

• Cultivos en monocapa: las células crecen adheridas sobre un soporte sólido (plástico o vidrio). Es el método utilizado para la mayoría de las células excepto por ejemplo las células hematopoyéticas.
• Cultivos en suspensión: las células se encuentran suspendidas en el medio de cultivo. Es el tipo de cultivo de las células hematopoyéticas, algunas líneas celulares transformadas y células tumorales.

Question 8

Línea celular.

Answer 8

En monocapa: separación de las células por métodos enzimáticos y se pasan a un nuevo frasco de cultivo.

• En suspensión: las células se diluyen en medio frasco.

Question 9

Implicaciones de formación de una línea celular a partir de un cultivo primario.

Answer 9

• Aumenta el número de células obtenidas.
• Acaban predominando uno o dos tipos celulares, los que tienen mayor tasa de crecimiento.
• La población celular se hace uniforme y homogénea.
• Sus características se conservan durante las sucesivas generaciones y, si se conservan en nitrógeno líquido, de forma indefinida.

Question 10

Vida de las líneas celulares.

Answer 10

• Vida finita: entre 20 y 100 generaciones.

- Superando este límite entran en la etapa de senescencia y pierden su capacidad de proliferar.

Question 11

Células tumorales.

Answer 11

• No entran en senescencia: crecen indefinidamente.
• Pueden surgir de forma espontánea.
• Son el resultado de un cambio genotípico denominado transformación.
• Son inmortales: crecen indefinidamente.
• Su crecimiento es aberrante: se pierde la inhibición por contacto, la limitación de la densidad celular durante la proliferación y la dependencia del anclaje.
• Son malignas: invaden tejidos y dan lugar al crecimiento de tumores.
• Son genéticamente inestables: son heteroploides, varía el número de cromosomas (presentan aberraciones cromosómicas).

Question 12

Operaciones de gestión de laboratorio de cultivo celular.

Answer 12

• Lavado, preparación y esterilización del material.
• Preparación y esterilización de medios de cultivo y reactivos.
• Mantenimiento y uso de los equipos del laboratorio (cabina de seguridad
biológica, incubadores, centrífugas, microscopios, dispositivos de pipeteo, etc.).
• Manipulación de los cultivos celulares.

Question 13

Áreas de las instalaciones.

Answer 13

• Área de gestión de material usado (lavado de material sucio).
• Área de esterilización de material y reactivos (material limpio).
• Área o laboratorio de cultivos celulares donde se manipulan y mantienen los
cultivos en cabinas de flujo laminar e incubadores

Question 14

Mantenimiento de la instrumentación y el equipamiento.

Answer 14

• Cabinas de seguridad biológica.
• Incubadores.
• Microscopios.
• Frigoríficos, congeladores y criogenizadores.
• Equipos de esterilización: autoclave y microfiltración.
• Otros instrumentos como centrífugas, contadores celulares, balanzas,
pipeteadores, etc.

Question 15

Mantenimiento de los cultivos celulares.

Answer 15

• Es realizado por personal formado para trabajar en condiciones limpias y
estériles (indumentaria adecuada, etc.)

Question 16

Nivel de Bioseguridad (NBS).

Answer 16

• En laboratorios con cultivos celulares se decidirá en función de una evaluación del riesgo.
• NBS 2 es el mínimo para el trabajo con cultivos celulares.

Question 17

Cabinas de seguridad biológica (CSB).

Answer 17

• Equipos utilizados para mantener el
  área en el que se manipulan los cultivos libre de posibles contaminantes, como
  bacterias y levaduras, que puedan contaminar el cultivo.
• Cabina proporciona flujo de aire filtrado con un filtro de alta eficiencia HEPA -> retiene partículas menores de 0.22 micrometros.

Question 18

Incubadores de CO2.

Answer 18

• Son los equipos en los que se mantienen los cultivos celulares
  pues proporcionan las condiciones idóneas para su mantenimiento en lo que se refiere a temperatura, humedad y porcentaje de CO2.
• Valores más habituales:
  · 37 ºC
  · 95% de humedad
  · 5% de CO2

Question 19

Microscopio.

Answer 19

• Instrumento óptico que permite visualizar el cultivo y llevar así el
  control morfológico de las células.
• Más utilizados: microscopios invertidos con contraste de fases
  · Fuente de iluminación y los objetivos se encuentran invertidos respecto a la platina de un microscopio óptico convencional
  · Permite visualizar células que apenas tienen contraste aumentando la calidad de la imagen.

Question 20

Frigoríficos, congeladores y criogenizadores.

Answer 20

• Neveras a 4 °C para el almacenamiento de medios, soluciones,…
• Congeladores a -20 °C para el almacenamiento de suero, antibióticos,
aminoácidos y soluciones enzimáticas (tripsina, colagenasa,…).
• Congeladores de -80 °C para el almacenamiento a largo plazo de los aditivos
del
• medio (suero, glutamina, antibióticos,…) y otros productos sensibles como
factores de crecimiento, mitógenos,…
• Instalación de nitrógeno líquido (-196 °C) para el almacenamiento a largo plazo
de las líneas celulares.

Question 21

Equipos de esterilización: autoclave y microfiltración.

Answer 21

• Autoclave: recipiente metálico de paredes gruesas con un cierre hermético que permite trabajar a alta presión.

• Esterilización por calor húmedo: mediante el empleo de autoclaves que generan
vapor de agua (gran poder de penetración en los materiales) a alta temperatura
capaz de desnaturalizar las proteínas de los agentes biológicos -> para esterilizar cualquier material termorresistente (vidrio, metales, etc.).

• Esterilización por calor seco: mediante el uso de estufas u hornos Pasteur -> proporcionan altas temperaturas (sin utilizar vapor de agua: se requieren tiempos más elevados, tiene menor poder de penetración). Se emplea para materiales de vidrio.

• Esterilización mediante filtración. Se utilizan filtros de membrana de acetato de
celulosa con poros de 0.22 ó 0.1 micrometros de diámetro. Se emplea para esterilizar la mayor parte de los medios de cultivo, sueros y cualquier solución que contenga elementos termolábiles.

Question 22

Procedimientos básicos de trabajo con cultivos celulares.

Answer 22

• Es conveniente descontaminar el área de trabajo y el material reutilizable antes y
después de trabajar con material biológico.

• Los cultivos se deben manipular en una CSB tipo II pues protege a la muestra, al
trabajador y al ambiente.

• Siempre se trabaja con material estéril (pipetas, tubos, botellas, medios, etc.).

• Es necesario identificar de forma adecuada los cultivos y todo el material biológico
que se encuentre dentro del laboratorio.

• Utilizar siempre equipos de protección individual (EPIs) como guantes y bata.

• Las manos deben lavarse antes y después de la manipulación de los cultivos
celulares.

• Siempre se debe descontaminar el material biológico antes de ser eliminado para
evitar su dispersión al medio ambiente:
· Los residuos líquidos se deben inactivar con un agente líquido descontaminante (lejía o similar).
· Los residuos sólidos pueden ser autoclavados y después ser eliminados como residuos convencionales.