Tecnologia del hibridoma Flashcards
hibridomas
celulas diseñadas para producir: anticuerpos monoclonales, los anticuepos son producidos por la tecnologia
1975- Kohler y Milstein usaron los hibridomas para generar anticuerpos monoclonales
anticuerpos monoclonales
anticuerpos monovalentes que se unen a una misma epitope, son producidos por una clona de linfocitos B, todos reconocen 1 epitope con la misma afinidad, 1 anticuerpo: 1 epitope
anticuerpos policlonales
mezcla de varios anticuerpos producidos por diversas copias de linfocitos B, estos reconocen y atan a muchos diversos epitopos de un unico antigeno
anticuerpos
producidos por: + clona de linfocitos B, cada uno reconoce un antigeno distinto o diferentes epitopes de un mismo antigeno, se obtienen inmunizando un animal con el antigeno de interes y purificando los anticuerpos que produce
estructura de los anticuerpos
estructura que reconoce y se une a antigenos
4 cadenas unidas por puentes disulfuro, 2 ligeras: region variable (sitio de union a antigeno) y region constante, 2 pesadas: region variable y constante
Produccion de anticuerpos
sintesis de inmunoglobulinas:
cel B maduras expresan IgM e IgD, cuando se activan: proliferan y se diferencian, cuando se transforman en cel plasmaticas secretan anticuerpos capaces de neutralizar a un antigeno especifico
procedimiento
1- raton inmunizado con antigenos, en el bazo proliferan celulas B con anticuerpos
2- se obtienen las cel B y se fusionan por electrofusion o polietilinglicol a cel de mieloma multiple, cultivadas en HAT
3- las cel hibridas se cultivan de 10-14 dias en HAT
4- las celulas hibridas se cultivan en pocillos separados y se analizan
5- las cel que contienen el anticuerpo apropiado se clonan
Produccion de anticuerpos
sintesis de inmunoglobulinas
cel B maduras expresan IgM e IgD, cuando se activan: proliferan y se diferencian, cuando se transforman en cel plasmaticas secretan anticuerpos capaces de neutralizar a un antigeno especifico
Tipos de anticuerpos monoclonales
murinos: -omab, 0% humano, pot inmunologico alto
quimerizacion: la region variable es la murina, 25%. raton, -ximab, Pot inmunologico intermedio
humanizacion: solo las regiones hipervariables de las cadenas liegras y pesadas son murinas, 10% raton, -zumab, potencial inmunologico bajo
humanos: -umab, 100% humanos, pot inmunologico bajo
Fagos
Fago M13, se inserta un genoma de una secuencia externa de ADN, estos fagos expresan en su superficie la prot codificada por el adn insertado
Tecnologia del Ribosoma Display
sintesis de anticuerpos monoclonales in vitro, aisla el gen de los anticuerpos de cel humanas mediante PCR, se genera el transcrito in vitro
aplicacion de los anticuerpos monoclonales
uso en investigacion, determinan las concentraciones de proteinas: pruebas de embarazo, tratamiento: enf oncohematologicas, rechazo a transplantes, reumatologia, cardiologia
Mecanismo de accion: anticuerpos monoclonales
union a:
receptores en la membrana, prot, prot circulantes, causa un efecto directo o indirecto sobre la funcion de un tejido
reacciones adversas de los anticuerpos monoclonales
inmunosupresion, respuestas inmunologicas, reacciones de hipersensibilidad, sd de liberacion masiva de citocinas: artralgias, mialgias, fiebre, hipo o hipertension, nauseas, vomito, rash cutaneo (reaccion alergica)
ADN RECOMBINANTE
formas de reproduccion pansexual de las bacterias
- transformacion: bacteria incorpora ADN libre, lo transforma en plasmido, pueden tener hasta 25 plasmidos
- conjugacion: 2 bacterias se unen, se replica el plasmido para que las 2 bacterias lo tengan
- transduccion: bacteriofago inserta su ADN en la bacteria, la bacteria genera bacteriofagos hasta morir
ADN RECOMBINANTE
secuencias de ADN derivadas de una mas fuerte
biotecnologia
aplicacion de las bases biotecnologicas para producir productos que pueden usarse para diagnostico, prevencion y tratamiento
ingenieria genetica, pasos
1- identificacion y aislamiento de un gen
2- seleccion y diseño de un vetor
3- ligacion del gen al vector
4- transformacion, transfeccion de clones recombinantes a cel huesped
5- seleccion de recombinantes y optimizacion de la integracion del gen en las cel huesped
Enzimas de restriccion
endonucleasas de restriccion, cortan nucleotidos en medio de ADN extraño, es un mecanismo de defensa de las bacterias. Degradan ADN extraño, NO degradan el propio ADN
Tipos de enzimas de restriccion
- endonucleasas: degradan ADN extraño, cortan enlaces fosfodiester en secuencias especificas, reconocen secuencias palindromicas, producidas por bacterias
- enzimas del sistema modificador: metilasas: modifican el propio ADN para que no sea degradado. metilacion en residuos de Adenina o citosina
nomenglatura de enzimas de restriccion:
1- primera letra del genero de la bacteria
2- nombre de la especie
acronimo de 3 letras cursivas
agregar letras o numero segun la cepa o serotipo
# romanos: de acuerdo a la cronologia que se aislaron
endonucleasas de restriccion, tipos:
I: corta 6-7 pares aleatorio, rio arriba o abajo
II: reconoce secuencias cortas de 4 a 8 pares, corta en la secuencia palindromica
III: corte lejos de la secuencia palindromica
IV: reconoce ADN metilado
tipos de corte
cohesivos: cortes en dif posicion, zig zag, deja Nucleotidos libres, 3-5 nt de diferencia
romos: corte simetrico en ambas cadenas
recombinacion de ADN
ADN de 2 fuentes diferentes se tienen que cortar con la misma enzima
los fragmentos generados por la misma enzima de restriccion son complementarios
vectores
molecula de doble cadena de ADN con capacidad de albergar un fragmento de ADN exogeno, 2 tipos:
- clonacion
- expresion
vectores de clonacion
almacenar secuencias, obtener mucho ADN, plasmido, bacteriofago, fagemidos, cosmidos (combinacion de un plasmido y bacteriofago), contienen: ORI-origen de replicacion, sitio multiple de clonacion (secuencia especifica que es reconocida por las enzimas de restriccion para insertar el adn complementario), marcador de seleccion (resistencia antibioticos, Gen lacZ- b- galactosidasa), prot verde fluorescente
vectores de expresion
producir un transcrito o proteina, plasmido o bacteriofago, contiene: ORI, sitio multiple de clonacion, promotor, IRES (sitio de entrada a ribosoma), secuencia de poli A
clonacion
origen de replicacion: ORI
sitio multiple de clonacion: secuencia especifica reconocida por las enzimas de restriccion para insertar ADN complementario
marcador de seleccion- AmP
expresion
origen de replicacion
sitio multiple de clonacion
promotor
IRES: sitios de entrada a ribosoma
secuencia de poli A
plasmidos
2 cadenas adn, circulares, separados del adn normal, NO es esencial,
bacteriofagos
virus que infectan a las bacterias, se modifican geneticamente, eliminan genes que no se requieren para la replicacion y empaquetamiento
cosmidos
vectores hibridos, se combina el ADN de un plasmido (gen de resistencia a los ab) con el de un bacteriofago (Cos-empaquetamiento)
Fagemidos
plasmido al que se le incorpora el ori de un fago
no tiene sitios cos
adn lineal
clonacion molecular
transformacion celular
el material genetico se incorpora de manera extracromosomica, se replica, se transcribe y se traduce
clonacion, pasos
1- preparacion del inserto que se va a clonar: enzimas de restriccion
2- preparacion del vector, desfosforilacion del vector, purificacion del plasmido
fragmento de adn se introduce en un plasmido
3- ligacion del inserto y el vector: adn ligasa
4- preparacion de cel competentes, permeabilidad de la membrana para aceptar el vector,
5- transformacion celular, adquisicion del gen, nuevo fenotipo a la celula
6- identificacion de las colonias celulares con el vector recombinante
nucleasas programables
enzimas modificadas geneticamente, reconocen secuencias especificas de un ADN. 2 monomeros: uno reconoce la secuencia, nucleasa
corregir y editar defectos geneticos
disrupcion, insercion, delecion
