Analisis de ADN Flashcards
Extraccion de adn
Va a depender de:
Tipo de acido N, organismo origen del aN, fuente del acido N, tecnica que utilizara en el AN extraido
Extraccion de adn, pasos
1- lisis de la celula
2- separacion
3- purificacion
4- precipitacion
5- lavado
6- disolucion
Tecnica de fenol-cloroformo
+ largo, + ADN, + errores
1- lisis de celula: cloruro de amoino (lisis eritrocitos), SDS (lisis de membranas celulares y nucleares)
2- extraccion de prot y lipidos con solventes organicos: Fenol: cloroformo: alcohol isoamilico
3- precipitacion de ADN: sol sallina saturada, etanol 100%
4- precipitacion
5- lavado de ADN: etanol 70%, agua
espectrofotometria
cualquier solucion con moleculas suspendidas permite el paso de luz a traves de ella
si la muestra absorbe + luz: + adn
ADN y ARN: abosrben 260nm
prot: 280nm, fenol: 270
fluorometria
union de colorantes fluorescentes al AN, absorbe una determinada longitud de onda y emite una luz superior, la concentracion es proporcional a la intensidad de emision fluorescente
colorante: Hoechst 33258
PCR
reaccion en cadena de la pol
mullis en 1986, necesidad de obtener un gran no. de copias de fragmentos de ADN, se basa en la replicacion
indica si un gen esta presente o no, cualitativa
PCR, requiere:
- secuencia de ADN
- enzima ADN pol: polimeriza una cadena de ADN: Taq (thermophilus aqu): 95ºC
- desoxirribonucleotidos: amortiguador da pH adecuado:8.4, cloruro de Mg (cofactor de Taq)
- primers: PCR iniciadores, reconocen secuencias blanco de ADN, proporcionan extremo 3’, 2 tipos: forward 5-3, reverse 3-5, tienen + GC
Pasos de la PCR
- DESNATURALIZACION: separar cadenas de ADN, a 95º, 20-30seg
- HIBRIDACION: los primer se alinean al extremo 3 con su secuencia complementaria, por la Tempertaura de alineamiento (depende de los primers): (4G+C)+(2A+T) Tm: 50-60º
- EXTENSION: temperatura de extension: 72ºC, Taq pol: actua sobre el complejo de primers, sintetiza cadena complementaria, 5-3
se repite 20-30 veces
al final se realiza un gel de electroforesis
electroforesis
separa las biomoleculas de una disolucion cuando se ven sometidas a un campo electrico, separa biomoleculas en base a su tamaño y carga electrica
electroforesis requiere:
- camara de electroforesis: genera campo electrico, tiene 2 polos que se conectan con una fuente de energia
- gel de agarosa: polisacarido de algas, separa fragmentos de ADN de100pb-25pb, la concentracion de agarosa es segun el tamaño del AN, el tamaño de los poros depende de la concentracion de agarosa, +agarosa: - poros,
- marcador de peso molecular: mezcla de moleculas de adn o prot de tamaño conocido, permiten determinar por comparacion el tamaño de las moleculas
- transiluminador ultravioleta
qPCR: reaccion en cadena de la polimerasa en tiempo real
deteccion de los productos amplificados en cada ciclo
es posible cuantificar la cantidad de ADN de la muestra, es el metodo mas sensible para detectar y cuantificar AN
qPCR: pasos
templado ADN
enzima: Taq pol
desoxirribonucleotidos trifosfatados
primers (oligonucleotidos)
magnesio
buffer
agua
sistema reportero fluorescencia
- especificos: sondas fluorescentes de oligonucleotidos con un reportero fluorescente, : Taq: quita la sonda liberando el cloroformo, generando una luz, que se capta, en tiempo real
- NO especificos: moleculas intercalantes que tienen afinidad por dobles cadenas de ADN, Syber green
PCR estandar caracteristicas
ampliacion de un segmento de ADN utilizando 2 partidores
deteccion cualitativa de un segmento de ADN
PCR multiple
amplificacion de 2 o mas segmentos de adn utilizando varios partidores
deteccion de varios segmentos de adn en una sola reaccion de pcr
PCR- RFLP
PCR estandar con paso posterior de digestion con enzimas de restriccion
deteccion de polimorfismos SNPs
RT- PCR
sintesis de cADN a partir de ARN mediante una transcriptasa reversa
deteccion de virus ARN
PCR-TR o qRPC
pcr estandar donde se utilizan tinciones o sondas con fluoforos para detectar los segmentos amplificados
deteccion cualitativa de uno o varios segmentos de adn. cuantificacion de ADN en la muestra (cargas) o expresion de genes
Tipos de cuantificacion
- absoluta: conocer el no exacto de copias amplificadas, concentracion precisa de AN, medir la carga viral o bacteriana
- relativa: evaluar los cambios en la expresion de genes en distintos estados fisiologicos. estos cambios se basan en los niveles del gen blanco comparados con un gen de referencia que no cambia su expresion
Northern BLOT
para detectar una secuencia de ARN usando ADN
Diseñada por: James Alwine, David Kemp, George Starck: 1977
Analogo del southern blot
SOUTHERN BLOT
Edwin sourthern- 1975
Detecta moleculas de ADN, secuencias especificas de adn
eastern blot
busca modificaciones en prot, usa: anticuerpos
WESTERN BLOT
Utilizado para detectar una prot especifica
ELISA
Es un test inmunologico muy sensitivo, se utiliza para la deteccion, cuantificacion de: anticuerpos, antigenos, prot, glucoproteinas y hormonas
Se realiza realizando complejos antigeno-anticuerpo
Se requiere: anticuerpo primario/ secundario, antigeno, buffer, cromogeno o sustrato
