SMLM & LSM Flashcards
Wofür steht SMLM? Was ist das generelle Prinzip? Wie hoch sind Fehler und Auflösung?
SMLM = Single Molecule Localization Microscopy
- Fluorophor Positionen nacheinander messen und mittels psf-Modell Position fitten
- > Genauere Bestimmung -> Bessere Auflösung
Fehler des Fits: s/Sqrt(N) ; N = Anzahl der Photonen
-> Fehler nimmt mit mehr Photonen ab
Auflösung: wenige nm
Welche Methoden gehören zur SMLM?
SHRImP (Single Molecule High Resolution Imaging with Photobleaching)
PALM (Photoactivated Localization Microscopy)
dSTORM (direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy)
DNA-PAINT (DNA-Point Accumulation In Nanoscale Topography)
BALM
Erläutern Sie das Prinzip von SHRImP
SHRImP (Single Molecule High Resolution Imaging with Photobleaching)
- Wenn zwei Fluophore sehr nah beieinander
- > Nur ein Punkt der leuchtet (nicht auflösbar)
- Bestrahlung der Fluophore mit Lasers führt zur schrittweisen Bleichung
- Position bestimmbar, indem Intensität des Hintergrund vom letzen Bild (nur noch 1 Flurophor aktiv) abgezogen wird -> Position 2!
- Position des anderen Flurophors bestimmbar, indem Intensität des ersten minus des zweites Bild gerechnet wird -> Position 1!
(Mittelpunkte durch psf-Modell bestimmt)
Erläutern Sie dSTORM. Was ist außerdem möglich?
dSTORM (direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy)
- Fluophore “blinken”
- > nur gewisser Teil im aktiven Zustand
- > Punkte sind weit genug voneinander entfernt (nicht Auflösungs-limitiert)
(psf-Modell fit)
- Gesamtes Bild aus Summe der Einzelbilder
(Lange Messung nötig)
Auch 3D Information möglich
Erläutern Sie DNA-PAINT. Welche Variation ist hier möglich?
DNA-PAINT (DNA-Point Accumulation In Nanoscale Topography)
- Zielprotein mit Einzelsträngigen DNA Stück markiert
- Komplementärstrang enthält Fluorophor
(Je nach Länge und Spezifität der Stränge wird Bindungsdauer definiert ~ ms)
- Fluophore bewegen sich schnell (Brown’sche Molekularbewegung) -> Position so nicht bestimmbar
- Während Bindung -> Signal statisch -> Position bestimmt -> Fluorophor geblichen
- Dann bindet nächstes -> Integration aller Signale an dieser Position
Auch mittels Antikörper möglich:
Primärer AK bindet an Protein -> Sekundärer AK Bindet an primären und enthält DNA Einzelstrang
Ordnen Sie diese Mikroskopie Arten nach ihrer Auflösung:
STED, STORM, Konfokal-M., SIM
Konfokal Mikroskopie ( ~ 150 nm)
SIM ( ~ 100 nm)
STED ( ~ 50 - 2 nm -> regulär eher 50)
STORM ( ~ 20 nm)
Welche Probleme treten bei der SMLM in der Strukturbiologie auf?
1) Effizientes labeln (markieren)
- Damit gesamte Struktur und nicht nur Teile sichtbar werden
z. B bei dsDNA, F-actin, Mikrotubuli - Fluorophore haben auch eine Größe -> Können nicht in alle Strukturen rein
- > Hülle der Struktur dargestellt
2) Seitenspezifisch labeln
- Hohe Spezifität der Fluorophore nötig
(wenig ungebundene oder falsch gebundenen Marker)
z.B. Monoklonale Antikörper, Seitenspezifische Biokonjugation, Genetische Fusion (CRISPR -> GFP)
3) Präzise Lokalisation
- Hohre Fluorophor Helligkeit
- Lokalizations algorithmen ( gute psf-Modelle etc)
Nennen Sie Anwendungen für die SMLM.
- z.B. Markierung des Cytoskellets (Mikrotubuli, Aktinfilamente, Intermediärfilamente)
- Fibronektin (Mechanotransduktoren)
Vergleichen Sie Epi-Illumination-, 2-Photon- und Lichblatt-Mikroskopie hinsichtlich:
Messdauer
Probengröße (x,y,z)
Photobleichung
Auflösung (z)
Verschiedene Winkel
Welche Vorteile bietet dich LSM?
LSM = Light Sheet Microscopy
- Dicke Proben möglich
- Lange Belichtung möglich, wegen geringer Bleichung
- Verschiedene Winkel möglich -> 3D Modell
- Aber nicht maximale Auflösung
Warum sind Zeitauflösung und Bleichung bei der LSM besser als bei z.B. der Konfokal Mikroskopie?
- Nur schmaler Teil der Porbe beleuchtet
(nicht betrachteter Teil wird nicht gebleicht)
- Detektion der Fluoreszenz kontinuierlich möglich
(Bessere Zeitauflösung)
Wie kann ein Lichtblatt erzeugt werden?
- Zylindrische Linse
(Brechung nur in einer Achse)
- Virtuell durch Anregungsobjektiv
(Scannen des Lichtblatts mit Detektionsobjektiv)
Welche Artefakte treten bei der LSM auf?
LSM = Light Sheet Microscopy
1) Artefakte der Struktur, welche Außerhalb des Fokusses liegen
* Lösung*: Beidseitige Beleuchtung oder Multi-view durch Rotation
- > Rekonstruktion
2) Streifen
Nennen Sie Varianten der LSM.
1) Epifluoreszenz
2) SPIM (Selective Plane Illumination Microscopy)
3) OCPI (wie Micro-Optical Sectioning Tomography)
4) Ultramikroskopie
5) mSPIM
6) HILO (Highly Inclined and Laminal Optical sheet)
7) Single lens SPIM
Welche Auflösung verbessert sich bei der LSM und um wie viel?
Auflösung in z-Richtung verbessert (in x,y unverändert)
- bei kleinen Vergrößerung ~ Faktor 3
- > Wichtig für große/dicke Proben
(FOV kleiner bei hoher NA)
