Lichtmikroskop Flashcards
Nennen Sie die Aufgaben des Objektivs und Okulars und wie sich die Gesamtvergrößerung ergibt.
Objektiv:
- Abbildung des Objekts -> erzeugt Zwischenbild
Okular:
- Lupe; Betrachtung des Zwischenbilds -> Auge
Vergrößerung:
MTot = MObj * MOk
(MObj = - fObj/x0,Obj)
Wo befinden sich Aperatur- und Gesichtsfeld-Blende? Wozu dienen diese? Wodurch entsteht die Telezentrik?
Aperaturblende:
- Helligkeit des Bildes
- Im Fokuspunkt des Objektivs
- Wird hinter dem Okular abgebildet
Gesichtsfeldblende:
- In Zwischenbildebene ( Fokuspunkt des Okulars)
- Wird mit abgebildet -> bestimmt Sichtfeldgröße
Telezentrik:
- Ensteht durch Aperaturblende (+ Okular)
- Eingehender und ausgehnder Strahl, sind Parallelstrahlen
Wie ergibt sich die Numerische Aperatur?
NA = n*sin(α)
- n = Brechungsindex
- α = Halber Öffnungswinkel der Linse
- Bestimmt minimale Größe eines Lichtflecks, der in der Fokusebene abgebildet werden kann
(Bei kleinem Öffnungswinkeln nicht genug Photonen eingefangen)
Wodurch wird der Abstand der Probe zum Mikroskop bestimmt?
- Durch die Brennweite der Objektivanordnung
(- Brennweite des Mikroskops ergibt sich aus Abständen des Objektivs zur Porbe und zum Okular sowie deren Vergrößerungen)
Welcher Problem lösen Immersionsflüssigkeiten? Nennen Sie zwei Beispiele.
- Auf Probe bedindet sich ein Deckglas (n ≈ 1,5)
- > Beim Durchlaufen des Strahls zum Objektiv kann Totalreflexion auftreten
kritischer Winkel:
Θkrit = arcsin(nMedium/nGlas)
- Je geringer der Brechungsindex (zw. Deckglas&Objektiv), desto geringer der Winkel für Totalreflexion
- > mehr Licht geht verloren
- Lösung:* Immersionsflüssigkeit
- > erhöhen Brechungsindex
z. B. Wasser (n ≈ 1,3) oder Öl (n ≈ 1,52) - bei Öl keine Totalreflexion
- > Größerer Halbraum -> mehr Photonen detektiert -> höhrer Kontrast
Was sind Paralleloptiken? Wie ergibt sich hier die Vergrößerung?
- Moderene Mikroskope besitzen Objektiv aus Lupe und Tubuslinse
- dazwischen: Paralleler Strahlengang
- hier Bautteile, für Bildkontrast oder Strahlteiler
- > werden nicht im Zwischenbild abgebildet
2 Betrachtungen:
1) Lupe + Tubuslinse = Objektiv:
- Objekt in Brennebene der Lupe -> scharf im Zwischenbild
- Okular als Lupe
2) Tubuslinse + Okular = Fernrohr:
- Objekt durch Lupe als Bündel von Parallelstrahlen ( wie unendlich weit entfernt)
- Fernrohr betrachtet Parallelstrahlen
Vergrößerung: MObj = - fTubus/fLupe
Was ist die Funktion des Okulars? Wie ergibt sich dessen Vergrößerung?
- Erzeugt Parallelstrahlen nach Zwischenbild -> scharf auf Retina abgebildet
- Strahlengang fast parallel -> Objekt vergrößert
- Zwischenbild in Brennweite des Okulars
Vergrößerung: MOk = 250 mm/f
(250 mm = deutliche Sehweite)
Erläutern Sie das Prinzip der Köhlerbeleuchtung. Was ist ein Vorteil?
- Ermöglich homogene ausgeleuchtete Bilder mit inhomogenen Lichtquellen
(Wichtig, da Kontrastunterschiede bei Mirkoskopie entscheidend sind)
- Vorteil*: Nur tatsächlich beobachteter Bereich beleuchtet -> Kein Streulicht
- Zwei Pfade des Lichts:
1) Bildgebend:
Hier Leuchtfeldblende; Beleuchtet Teil des Präparats -> Größe des Bildbereichs
2) Beleuchtend:
Hier Aperaturblende; Begrenzt Anteil des Lichts von der Quelle -> Helligkeit des Bildbereichs
-> Aufeinder Abstimmen für optimales Bild
Wie ändert sich die Auflösung des Lichtmikroskops durch dezentrale Beleuchtung?
(dezentrale Beleuchtung = Beleuchtung mittels Kondensor)
Von d = 0,61*λ/NA zu
d = 1,22*λ/(Kondensor NA + Objektiv NA)
- Kondensor Pinhole offen: weniger Kontrast, mehr Auflösung
- Kondensor Pinhole geschlossen: mehr Kontrast, weniger Auflösung
Was ist die Abbe’sche Theorie der Bildentstehung?
Methode um Abbildung eines Objekts mittel Gitter zu beschreiben
Nutzt: Kohärent, monochromatisches und paralleles Licht
Erläutern Sie den Bildentstehungsprozess nach der Abbe’schen Theorie. Was ist die Bedingung für ein scharfes Bild?
1) Fraunhofer Beugungsmuster des Gitters in Brennebene der Linse
2) Beugungsordnung wie äquidistante Punktlichtquellen
- > In der Bildeben entsteht deren Beugungsmuster
- Für ein scharfes Bild müssen alle Beugungsordnungen in der Bildebene konvergieren
Wie lautet das Abbe’sche Sinustheorem?
sin(ϴj)/sin(ϴj’) = m (magnifigation/Vergrößerung)
ϴ = Austrittwinkel Objekteben
ϴ’ = Einfallswinkel Bildebene
j = Beugungsordnung
Erläutern Sie die Abbe’sche Theorie für ein beliebiges Objekt. Welche Eingenschaften lassen sich daraus für das Bild erkennen?
- Nutzt Transmissionfunktion des beleuchteten Objekts
(Beschreibt Beugung)
- Linse porjiziert Fraunhofer Beugungsmuster in Brennebene
- > Transmissionsfunktion einsetzen in Fraunhofer Beugung
- > Amplituden in Bildebene kombiniert mit Fraunhofer Beugungsmuster
- > Ergibt Rücktransformierte einer Fourier Transformation
(Nutze Fermat’sche Prinzip zur Auflösung)
- > Bild
(also: Doppelte FT; 1. FT durch Objekt; 2. FT durch Fokussierung Linse; Rück-FT durch Beungungsmuster in Brenneben der Linse) - Eigenschaften*: Bild ist invertiert und um Faktor m vergrößert
Was sind räumliche Filter?
Bauteile, in der Brennebene der Linse, welche Abbildungseigenschaften verändern
Wie lautet nach der Abbe’schen Theorie die Auflösung?
- Für minimale Periodizität muss mindestens die erste Beugungsordnung die Linse passieren
(0. te Ordnung keine Information über Gitterstruktur. Erst +1.te mit -1.te Ordnung zusammen liefern diese Info)
(Alle höheren Ordnungen in der Brennebene haben Info über jeden Punkt der Objektebene, nämlich Abstand zum Maxium 0. Ordnung. Dieser ist Abhängig von den Abständen in der Objektebene -> Gitterkonstante)
- d.h. Öffungswinkel α muss größer sein als ϴ1 (Austrittswinkel der ersten Ordnung aus Objektebene)
dmin = 0,61*λ/NA
Nennen Sie Methoden zur Kontraststeigerung. Was ist meist nötig und warum?
1) Phasenkontrastmikroskopie
2) Dunkelfeldmikroskope
3) Differential Interference Contrast (DIC)
* Nötig*: Kohärente Wellen
- Verstärkung und Auslöschung von Maxima/Minima
Räumliche Kohärenz: Durch Pinhole
Zeitliche/Wellenlängen Kohärenz: Durch Wellenlängen Filter/ Gitter
(Kohärenzlänge: Dort wo Kohärenzgrad auf 1/e abgefallen ist)
Erläutern Sie die Phasenkontrastmikroskopie. Wie sind die Organellen dargestellt? Wie wird diese umgesetzt?
- Sensitiv gegenüber der Änderung der absoluten Phase des Lichts durch das Objekt
(z. B. Mitochondrium, Zellkern, Lysosomen, z.T. Chromatin -> dunkel
“Liquid Troplets”, Vesikel -> hell)
- Phasenshift auf nullte Ordnung aufbringen
- Gestreutes Licht, durchläuft nicht durch Phasenring, aber:
Phasenänderung durch Brechungsindex der Probe
- > In Bildebene Interferenz von Hintergrund- und Objektlicht
- > Kontrast
- Umsetzung*: Ringblende vorm Kondensor (beschränkt Einfallswinkel) + Phasenring nach Objektiv
- > λ/4 Phasenverschiebung in nullter Ordnung
Erläutern Sie die Dunkelfeldmikroskopie. Wie wird diese umgesetzt?
- Nicht gestreutes Licht (nullte Beugungsordnung) wird komplett ausgeblendet
- Hintergrund dunkel, Präperat hell
- > Fast transparente Proben besser sichtbar
- Umsetzung*: Mittels Kondensor (höhere NA als Objektiv)
- Direktanregung gelangt nicht zum Detektor
- > nur Streulicht detektiert
Erläutern Sie die DIC-Mikroskopie. Wie wird diese umgesetzt?
DIC = Differential Interference Contrast
- Unterschiede in der optischen Weglängen zweier benachbarter Punkte (der Probe) werden durch Helligkeitsunterschieden dargestellt
- Umsetzung*:
- Polarisator -> linear polarisiertes Licht
- Wollaston Prisma -> Aufspaltung in zwei senkrecht zueinander polarisierte Strahlen
- Beleuchtung der Probe -> Unterschiedlcihe Verzögerung/optische Weglänge
- 2tes Wollaston Prisma -> Kombination der Strahlen
- > Bildkontrast durch Interferenz der Strahlen (konstrukiv/destrukiv)
- Ellipische polarisiert
- Analysator entfernt direkt transmittiertes Licht
- > Bild
Was ist der Unterschied zwischen Phasenkontrastmikroskopie und DIC-Mikroskopie
DIC = Differential Interference Contrast
DIC: Empfindlich gegenüber Änderungen der Phase
PKM: Empfindlich gegenüber absoluter Phase
Erläutern Sie die Funktionsweise einer CCD-Kamera.
Warum sind unterschiedliche Chips nötig?
- Silizium Chip ist Kernelement
- Gitternetz aus transperenten Elektroden darüber
- Wenn Photon auf Siliium trifft
- > Elektron ausgelöst (Photo-Effekt)
- > Elektron durch Elektroden aufgenommen & gespeichert
- Pixelkapazität: 1.000 e-/μm2
- Quanteneffizienz der Chips abhängig von der Wellenlänge
- > Unterschiedliche Chips/Kameras je nach Wellenlänge
Quanteneffizienz = Wahrscheinlichkeit des Auslösen eines e- wenn Photon auftritt
Wie werden CCD-Kameras unterschieden?
Nach den 3 Auslesevorgängen:
- Pixel immer Zeilenweise + seriell ausgelesen
1) Full Frame:
- Gesamte CCD Kamera beleuchtet & sukzessiv ausgelesen
- Digitalisierung ist zeitlich limitierender Schritt
2) Frame-Transfer:
- Chip in 2 Teile: Belichtungs- & Speicherfläche
- Nach Belichtung -> Bild in Speicherfläche verschoben
- > Auslesung möglich, während nächste Belichtung stattfindet
3) Interlined-Transfer:
Wie “Frame-Transfer”, aber Bild- und Speicherfläche in Streifen
Vorteil: sehr schnelle Auslesung, da kürzere Weglängen
Nachteil: Bild hat Streifen (kein Gesamtbild)
Welche Prozesse führen zur Bildverschlechterung?
1) Dunkelstrom: durch thermisch generierte Elektron-Löcher -> kühlen
2) Ausleserauschen: durch Ungenauigkeit des AnalogDigital-Wandlers
3) Energiereiche Strahlung: generieren Elektron-Löcher in großen Mengen -> filterbar
Was sind EMCCDs?
Electron multiplying CCDs
- basiert auf Frame-Transfer CCDs
- Multiplikator vor Ladungskonversion (Auslesung)
- Dieser besteht aus mehreren Registern
- Hohe Spannungen sorgen in jedem Register für Stoßionisationen
- > erhöht Anzahl von Elektronen
- > kleiner Signale besser erkennbar
Was besagt das Nyquist Theorem? Was bedeutet dies für die Mikroskopie?
- Für optimale Auflösung periodischer Strukturen, muss mindestens 3-faches oversampling gewählt werden
- d.h. Jede Periode auf 3 Pixel abgebildet
- sonst “Aliasing” -> Strukutren mit falscher Periodizität
- Mikroskop:*
- Wenn dmin ≈ λ/(2*NA); bei rotem Licht λ ≈ 600 nm (NA = 1)
- > dmin ≈ 300 nm (kleinste Auflösung)
Nyquist Theorem angewendet: Für optimale Auflösung muss Pixelgröße 300 nm : 3 = 100 nm sein
- Bei zu vielen Pixeln -> Rauschen, da Photonausbeute der Probe limitiert
Wodurch ist die Auflösung eine Mikroskops begrenzt?
- Durch Beugungseffekte
- > Punktlichtquelle wird zur point-spread-function
(Airy-Scheibe ist die Größe des 1. Maxium als Querschnitt der psf)
- > Dadurch wird dmin definiert
- Abhängig von Wellenlänge und NA
Was ist der Unterschied zwischen Hellfeld- und Phasen-Mikroskopie? Was wäre ein Vorteil der Phasen-Mikroskopie?
Hellfeld-Mikroskopie: Beruht auf Absorption des Lichts durch die Probe
(Amplitude verringert)
Phasen-Mikroskopie: Beruht auf Phasenänderung des Lichts durch die Probe (Unterschiedliche Geschwindigkeiten des Lichts je nach Brechungsindex)
- > Diese werden dann in hell/dunkel dargestellt
- Vorteil*: Objekte, die nur wenig Licht absorbieren, können ohne weitere Markierungen in der Phasen-Mikroskopie dargestellt werden
