Fluoreszenzmikroskop Flashcards
Warum gibt es unterschiedliche Fluoreszenzfarbstoffe? Was sind die Möglichkeiten?
- Binden unterschiedliche Organellen
- > Färbung -> Fluoreszenzmikroskopie
- Auch mittels spezifischer Antikörper möglich
- Auch Detektion von Minralien möglich
(z. B. mit Ca2+, da manche Fluorophore sensitiv gegenüber Änderung der Elektrondichte/Eigenschaften)
Welche Möglichkeiten gibt es Fluoreszenzfarbstoffe zu labeln? Nennen Sie Beispiele für Fluorophore.
- Proteine oder Lipid direkt and Fluorophor gebunden
- Visualisierung von Zell-Strukturen, Proteine mittels Liganden oder Umgebungsabhängigkeiten
Fluorophore z.B.:
- Antikörper
- Proteine (GFP, YFP)
- organische Moleküle
- Streptavidin (spezifische/starke Bindung)
- Gold-Kugel
- Quantendots
Wie sind Absorption und Emission definiert?
Absorptionsrate:
absorbierte Photonen/Zeit = Photonenfluss * Absorptionsquerschnitt
Emission:
- Stokes Shift (Rotverschiebung)
- Ist eine Sättigungskurve (wenn über Intensität aufgetragen)
(ein Fluorophor kann nicht beliebig viel emittieren)
- Linearer Zusammenhang für kleine Intensitäten
- Zu beachten: Nichtstrahlungs-Übergänge (also Quantenausbeute) und Effizienz des Detektors -> Korrektur der Fluoreszenz-Emission
Wovon hängt die Anregungswahrscheinlichkeit ab?
Von der Polarisation des Lichts
- Da Winkel zwischen Absorptionsdipolmoments (Fluorophor) und der Richtung des E-Feldes (eingestrahltes Photon) entscheidend ist
Erläutern Sie Photobleichen. Wovon hängt es ab?
- Zusätzlicher Pfad im Jablonski-Schema (kbl)
- Fluorophor wechselt von angeregten in inaktiven Zustand
- > Begrenzte Beobachtungszeit
- kann reversibile sein
- Abhängig von:*
- Sauerstoff
- Intensität
- Umgebung beeinflusst Rate
Was ist GFP? Wie ist es aufgebaut? Was sind die Vorteile?
GFP = Green Fluorescent Protein
- Aus Qualle, mit Punktmutationen zur Verbesserung ( Aus Dimer -> Monomer)
- 500 nm (Emission)
Aufbau:
- Chromophor im Zentrum
- 11 Beta-Faltblätter
- > stabilisieren Chromophor
- > Keine Isomerisierung oder Rotation des Chromophors möglich
- > gute Photostabilität
Vorteile:
- Kann durch Gentechnik (CRISPER/Cas9) direkt an zu untersuchendes Protein gebunden werden
- > werden dann zusammen exprimiert
- gut in lebenden Zellen einsetzbar
Welches Prinzip nutzt das Fluoreszenz Mikroskop aus? Wie sieht der Aufbau schematisch aus?
- Emission ist wegen des Stokes-Shifts verschoben
- > Dichroidischer Strahlteiler reflextiert Anregungslicht und transmittiert Fluoreszenz-Emission
- Excitation-Filter: Für monochromatische Anregung
- Emission-Filter: Um restliches Anregungslicht zu filtern (dieses ist um 6 Größenordnungen intensiver als die Fluoreszenz)
Auf welche optischen Bautteile lassen sich die Graphen zurückführen?
Links
Rot: Emissions Filter
Blau: Exzitations Filter
Grün: Dichroidischer Spiegel
Rechts
- Triple Band Filter
- Für mehrere Anregungswellelängen
Wie ergibt sich die Detektionseffizienz?
Produkt aus:
1) Sammeleffizienz des Objektivs
2) Sammeleffizienz des Filters
3) Detektionseffizienz der Kamera
Nennen Sie Anwendungen der Fluoreszenz Mikroskopie.
1) Ca2+ Imaging:
- z.B. T-Cell Aktivierung oder Reizweiterleitung bei Neuronen
- Anwesenheit von Ca2+ ändert Emissionwellenlänge der Indikatoren
- Indikatoren meist AM-Ester -> Membranpermable
- Esterasen im inneren der Zelle schneiden AM Gruppe ab
- > Indikator in Zelle “gefangen”
- Nach Kalibrierung lässt sich mittels Emission auch Ca2+ Konzentration betimmen
2) FRET
- 1/r6 Abhängigkeit der Effizienz
3 Bedingungen:
1) Überlapp des Emissions Spektrums des Donors mit Absorptionsspektrum des Akzeptors
2) Ausrichtung des Übergangsdipolmoments von Donor und Akzeptor (parallel -> 100%; senkrecht -> 0%)
3) Abstand: zwischen 1 bis 10 nm
3) Miniaturized device
- Kleine Mikroskope
- könnnen in lebende Tiere implantiert werden
- z.B. Neuronenaktivität in laufender Maus untersuchen
