AFM & SIM Flashcards
Erläutern Sie die (linear/non-linear)SIM.
SIM = (Nonlinear) Structured Illumination Microscopy
- Nutzt Moiré Muster:
- Ergeben sich aus Überlagerung zweier periodischer Strukturen
- > Wellenlänge reduziert
- Periodische Probe mit mittels periodischem Gitter beleuchtet
(Rotation und Translation des Gitters)
- > Kreuzkorellation im Fourier-Raum
- > höhere Frequenz im k-Raum
- > bessere Auflösung (lateral + axial -> 3D-SIM)
- Bei linearer Beleuchtung: Auflösung um Faktor 2 verbessert
(Anregungswahrscheinlichkeit oszilliert als Sinus-Fkt. zwischen 0 und 1)
- Bei nicht linearer Beleuchtung: Auflösung noch weiter verbessert
(noch mehr hohe Frequenzen im k-Raum)
(nicht linear = periodisch, aber nicht Sinus/Cosinus)
Was kann mit AFM gemessen werden? Was ist hier ein Problem?
Variante der “scanned proximity probe microscopy”
- Lokale Eigenschaften der Probe:
- Höhe
- Absorption
- Fluoreszenz
- Magnetismus (magnetische Spitze)
- Kräfte
- Problem*: Messung an kleiner Probenfläche -> Dynamik schwierig
- Nur zwei Dimensionen
Wodurch wird die Auflösung der AFM bestimmt? Wie hoch ist diese?
AFM = Atomic force microscopy
- Durch schärfe der Spitze
- Durch Scan-Schritte
Auflösung = 0,01 nm
(Fast besser als klassiche X-Ray Kristallographie)
Was misst die AFM und wie?
Anziehende und abstoßende Kräfte zwischen Spitze und Probe
- mittels dünner Spitze an Cantilever
- Auslenkung des Cantilever wird durch reflektierten Laserstrahl an Photodiode gemessen
Was wird für die AFM benötigt?
- Sensitive Detektion
- Flexible Cantilever
- Scharfe Spitze (Radius, höhe, breite)
- Force-feedback Loop
- Hochauflösende Positionierung von Probe und Spitze
(mittels Piezo-Aktuator)
Warum ist die Federkonstante wichtig bei der AFM? Wie lautet die Resonanzfrequenz?
Federkonstante des Cantilevers ~ 1 N/m
- Flexibeler Cantilever
- > Geringe Kraft
- > Wenig Probenschädigung
- Cantilever haben geriner Masse -> hohe Resonanzfrequenz
Welche Arten von Cantilever gibt es?
V-shaped:
- wenig Torsion (Verdrehung)
Single-arm:
- Hohe Torsion
- > Bestimmung von mechanischen Eigenschaften der Probe
(Vier-Segment-Photodiode)
Wie kommt es zur Bildern bei der AFM?
- Laserstrahl an Goldoberfläche des Cantilevers reflektiert
- > Auslenkung an Zwei/Vier-Segment-Photodiode gemessen
- Bild durch rastern der Probe
- Schrittweite des rasterns bestimmt die Auflösung
Wie funktioniert der Feed-back loop bei der AFM?
- Nicht nur Kraftmessung, sondern auch regulation
- Summensignal vom Photodetektor (positiv = oben, negativ = unten)
- Summensignal auf Null gehalten
- Wenn z.B. nach oben ausgelenkt
- > Summe positiv -> mehr Kraft -> wieder auf Null
- Gleichzeitig dieses Signal für Topographie speichern
Wie sieht das Lennard-Jones-Potential aus und was ist dessen einfluss auf die AFM?
- Anziehende Kräfte durch Van-der-Waals WW (~ - 1/r6)
- > Nicht-Kontakt (tapping-phase?) Modus der AFM
- Abstoßende Kräfte durch Pauli Prinzip (~ 1/r12)
- > Kontakt Modus der AFM
Erläutern Sie den Kontakt und Nicht-Kontakt Modus der AFM. Was wären Probleme?
Kontakt Modus:
- Spitze und Probe in nahem Kontakt (bei Biologie eher ungeeignet)
- Abstoßende Kräfte drücken Spitze von Probe weg
- Problem*: laterale Kräfte können Probe schädigen
Nicht-Kontakt Modus:
- Sptize oszilliert über Probe
- Anziehende Kräfte mit der Probe dämpfen die Schwingung
- Phasenbild ergibt Steifigkeit, Viskoelastizität und chemische Zusammensetzung der Probe
- Problem*: Nicht in wässrigem Milieu -> Überdämpfung der Oszillation
Nennen Sie Anwendungen für die AFM.
1) Spermien Zellen:
3D Profil
2) Interaktionen zwischen Biomolekülen:
Molekül A auf Spitze und Molekül B auf Probe
- > Mit Spitze in Probe drücken
- > Beim wegziehen die “ruption-force” über die Entfernung messen
3) Biosensor: - Konzentrationen messbar
- Anzahl der Moleküle an Cantilever gebunden
4) Magnetische Interaktion: - Magnetische Parikel im Magnetfeld
- Mittels Anitkörper an Probe gebunden
5) Einzelmolekülmessungen: - z.B. Protein mit Biotin gebunden -> Streptavidin an Spitze
- Inhibition gut messbar -> Keine Kraft/Interaktion/Auslenkung
6) Entfaltung von Proteinen: - Überprüfung von Sekundär/Tertiär/Quartär Struktur der Protein
- Kraft an Protein zieht dieses auseinander
Was ist 3D-SIM?
= Lateral (2D) + Axial (1D) Structured Illumination Microscopy
(3-Farben und 3D optical sectioning)
- 15 Bilder pro Ebene ( 5 Verschiebungen und 3 Winkel des Gitters)
- > Frequenzraum erweitert -> Auflösung verbessert (Faktor 2-3)
- Bei z-scan -> schnell sehr viele Bilder nötig
- > Viel Zeit -> Dynamik limitiert
=> Rekonstruktion am PC nötig
Wie verhalten sich Frequenz und Auflösung zueinander?
- Kleine Abstände
- > Hoher Winkel zwischen 0ter und 1ter Beugungsordnung
- > Hohe Frequenzen im k-Raum
- Hohe NA nötig für deren Auflösung
Was ist die Cut-off Frequenz?
= 2 NA/λ
- Aus Darstellung im Fourier-Raum
- Im Prinzip die Auflösung
- Mehr Frequenzen im k-Raum entsprechen höherer Auflösung
Nennen Sie Anwendungen für 3D-SIM.
- Detaillierte Auflösung kann Aufschlüsse über neue Biologie bringen
1) Untersuchung von Chromatin
2) Phasen der Zellteilung
3) Kernporen - Lamin stellt Verbindung zwischen Zellkernhülle und Chromatin her
und viele mehr…
Was ist das Problem bei 3D-SIM?
- 15 Bilder pro Ebene nötig -> Bleichung der Probe
- Zeitliche Auflösung limitiert, da viele Bilder nötig
- Trotzdem möglich
Welche Rekonstruktionsartefakte kennen Sie bei SIM?
1) Streifen im Bild:
- Durch Bleichung oder Vibration
2) Hoch-Frequentes Rauschen:
- Wenn geringes Signal-zu-Rausch Verhältnis
- > geringer Kontrast
3) Halo/ Doubling:
- Durch Spährische Aberration
- Brechungsindizes (von was?) nicht gleich
Welche Abwägungen müssen bei SIM, aber auch generell, getroffen werden?
Zwischen Signal-zu-Hintergrund-Verhältnis im Gegensatz zur Bleichung
Signal: System Sensitivität, Anregungsintensität, Dichte der Markierung, Helligkeit
Hintergrund: Kamera-Rauschen, Autofluoreszenz, Unspezifische Markierung und Streulicht
Bleichung: Photostabilität, z-scan
Außerdem: Wenig Photoschädigung, Räumliche Auflösung, Zeitliche Auflösung oder mehrere Dimensionen (z-Richtung, Zeit, Wellenlängen)
Was wird allgemein für gute Bilder benötigt?
1) Gutes und spezifisches labeln
2) Gute Qualität der Probe
3) Hardware (Photon Effizienz, Stabilität, Kameras)
4) Prozessierung der Daten (psf)
5) Statistische Analyse
