AFM & SIM Flashcards
Erläutern Sie die (linear/non-linear)SIM.
SIM = (Nonlinear) Structured Illumination Microscopy
- Nutzt Moiré Muster:
- Ergeben sich aus Überlagerung zweier periodischer Strukturen
- > Wellenlänge reduziert
- Periodische Probe mit mittels periodischem Gitter beleuchtet
(Rotation und Translation des Gitters)
- > Kreuzkorellation im Fourier-Raum
- > höhere Frequenz im k-Raum
- > bessere Auflösung (lateral + axial -> 3D-SIM)
- Bei linearer Beleuchtung: Auflösung um Faktor 2 verbessert
(Anregungswahrscheinlichkeit oszilliert als Sinus-Fkt. zwischen 0 und 1)
- Bei nicht linearer Beleuchtung: Auflösung noch weiter verbessert
(noch mehr hohe Frequenzen im k-Raum)
(nicht linear = periodisch, aber nicht Sinus/Cosinus)
Was kann mit AFM gemessen werden? Was ist hier ein Problem?
Variante der “scanned proximity probe microscopy”
- Lokale Eigenschaften der Probe:
- Höhe
- Absorption
- Fluoreszenz
- Magnetismus (magnetische Spitze)
- Kräfte
- Problem*: Messung an kleiner Probenfläche -> Dynamik schwierig
- Nur zwei Dimensionen
Wodurch wird die Auflösung der AFM bestimmt? Wie hoch ist diese?
AFM = Atomic force microscopy
- Durch schärfe der Spitze
- Durch Scan-Schritte
Auflösung = 0,01 nm
(Fast besser als klassiche X-Ray Kristallographie)
Was misst die AFM und wie?
Anziehende und abstoßende Kräfte zwischen Spitze und Probe
- mittels dünner Spitze an Cantilever
- Auslenkung des Cantilever wird durch reflektierten Laserstrahl an Photodiode gemessen
Was wird für die AFM benötigt?
- Sensitive Detektion
- Flexible Cantilever
- Scharfe Spitze (Radius, höhe, breite)
- Force-feedback Loop
- Hochauflösende Positionierung von Probe und Spitze
(mittels Piezo-Aktuator)
Warum ist die Federkonstante wichtig bei der AFM? Wie lautet die Resonanzfrequenz?
Federkonstante des Cantilevers ~ 1 N/m
- Flexibeler Cantilever
- > Geringe Kraft
- > Wenig Probenschädigung
- Cantilever haben geriner Masse -> hohe Resonanzfrequenz
Welche Arten von Cantilever gibt es?
V-shaped:
- wenig Torsion (Verdrehung)
Single-arm:
- Hohe Torsion
- > Bestimmung von mechanischen Eigenschaften der Probe
(Vier-Segment-Photodiode)
Wie kommt es zur Bildern bei der AFM?
- Laserstrahl an Goldoberfläche des Cantilevers reflektiert
- > Auslenkung an Zwei/Vier-Segment-Photodiode gemessen
- Bild durch rastern der Probe
- Schrittweite des rasterns bestimmt die Auflösung
Wie funktioniert der Feed-back loop bei der AFM?
- Nicht nur Kraftmessung, sondern auch regulation
- Summensignal vom Photodetektor (positiv = oben, negativ = unten)
- Summensignal auf Null gehalten
- Wenn z.B. nach oben ausgelenkt
- > Summe positiv -> mehr Kraft -> wieder auf Null
- Gleichzeitig dieses Signal für Topographie speichern
Wie sieht das Lennard-Jones-Potential aus und was ist dessen einfluss auf die AFM?
- Anziehende Kräfte durch Van-der-Waals WW (~ - 1/r6)
- > Nicht-Kontakt (tapping-phase?) Modus der AFM
- Abstoßende Kräfte durch Pauli Prinzip (~ 1/r12)
- > Kontakt Modus der AFM
Erläutern Sie den Kontakt und Nicht-Kontakt Modus der AFM. Was wären Probleme?
Kontakt Modus:
- Spitze und Probe in nahem Kontakt (bei Biologie eher ungeeignet)
- Abstoßende Kräfte drücken Spitze von Probe weg
- Problem*: laterale Kräfte können Probe schädigen
Nicht-Kontakt Modus:
- Sptize oszilliert über Probe
- Anziehende Kräfte mit der Probe dämpfen die Schwingung
- Phasenbild ergibt Steifigkeit, Viskoelastizität und chemische Zusammensetzung der Probe
- Problem*: Nicht in wässrigem Milieu -> Überdämpfung der Oszillation
Nennen Sie Anwendungen für die AFM.
1) Spermien Zellen:
3D Profil
2) Interaktionen zwischen Biomolekülen:
Molekül A auf Spitze und Molekül B auf Probe
- > Mit Spitze in Probe drücken
- > Beim wegziehen die “ruption-force” über die Entfernung messen
3) Biosensor: - Konzentrationen messbar
- Anzahl der Moleküle an Cantilever gebunden
4) Magnetische Interaktion: - Magnetische Parikel im Magnetfeld
- Mittels Anitkörper an Probe gebunden
5) Einzelmolekülmessungen: - z.B. Protein mit Biotin gebunden -> Streptavidin an Spitze
- Inhibition gut messbar -> Keine Kraft/Interaktion/Auslenkung
6) Entfaltung von Proteinen: - Überprüfung von Sekundär/Tertiär/Quartär Struktur der Protein
- Kraft an Protein zieht dieses auseinander
Was ist 3D-SIM?
= Lateral (2D) + Axial (1D) Structured Illumination Microscopy
(3-Farben und 3D optical sectioning)
- 15 Bilder pro Ebene ( 5 Verschiebungen und 3 Winkel des Gitters)
- > Frequenzraum erweitert -> Auflösung verbessert (Faktor 2-3)
- Bei z-scan -> schnell sehr viele Bilder nötig
- > Viel Zeit -> Dynamik limitiert
=> Rekonstruktion am PC nötig
Wie verhalten sich Frequenz und Auflösung zueinander?
- Kleine Abstände
- > Hoher Winkel zwischen 0ter und 1ter Beugungsordnung
- > Hohe Frequenzen im k-Raum
- Hohe NA nötig für deren Auflösung
Was ist die Cut-off Frequenz?
= 2 NA/λ
- Aus Darstellung im Fourier-Raum
- Im Prinzip die Auflösung
- Mehr Frequenzen im k-Raum entsprechen höherer Auflösung
Welche Rekonstruktionsartefakte kennen Sie bei SIM?
1) Streifen im Bild:
- Durch Bleichung oder Vibration
2) Hoch-Frequentes Rauschen:
- Wenn geringes Signal-zu-Rausch Verhältnis
- > geringer Kontrast
3) Halo/ Doubling:
- Durch Spährische Aberration
- Brechungsindizes (von was?) nicht gleich
