Moderne Methoden Lichtmikroskopie Flashcards
Was ist die Besonderheit von SNOM?
Scanning Near-field Optical Microscopy = SNOM
- Benötigt keine Linsen
- Nur Strukturen die größer als Lichtwellenlänge sind, sind im Fernfeld auflösbar
- > Detektor näher an Probe
- > Nahfeld liefert ebenfalls Signalbeitrag
Was ist das Kernstück von SNOM? Welche Auflösungen können erreicht werden?
Scanning Near-field Opticlal Microscopy
Kernstück: Glasfaser, am ende zugespitzt (Tip)
-> Wird als Punktlichtquelle zur Anregung verwendet
(kleiner als Fokuspunkt herkömmlicher Fluoreszenz-Mikroskope)
- > Geringer Teil der Probe beleuchtet und geringer Abstand
- > Rastern der Probe
- (nachgeschaltete Punktdetektoren)
- > Besser Auflösung (~50 nm)
Was ist der Nahfeldeffekt? Was ist die “decay length”?
Nahfeldeffekt:
- Fluoreszenzintensität nimmt exponetiell mit Abstand ab
- > Größeres Feld, wenn näher an Probe
- > Auflösung nimmt mit Abstand ab
decay length:
- Dort wor Intenstität noch 50% beträgt
Wie wird bei SNOM der Abstand zur Probe eingestellt?
- Stimmgabel (tuning fork) wird in Kontakt mit Tip gebracht und oszilliert
- Wenn sich Tip der Probe nähert
- > Reibungskräfte dämpfen Oszillation
- > Dämpfung wird gemessen -> Input für feedback loop
- > korrekter Abstand zur Probe (über z-Piezo) eingestellt
- Abwägung, ob geringer Kontakt für mehr Auflösung oder Probenschädigung wichtiger
Nennen Sie Anwendungen für SNOM.
Scanning Near-field Optical Microscopy
Phasenseparation in Lipid-Monolagen
Einzelmolekül-Studien
- sehr gutes Signal/Hintergrund Verhältnis
- Messung Übergangsdipolmomente einzelner Moleküle
Einzelmolekül-Spektroskopie
- Veränderte Lebensdauer des Fluorophors durch Aluminium an Tip
- > Lebensdauer als Funktion der Molekülposition
Nennen Sie Vorteile und Nachteile von SNOM.
Scanning Near-field Optical Microscopy
Vorteile:
- Hohe Auflösung ~ 70 nm
- Geringes Anregungsvolumen: Eindringtiefe ~ 50 nm
- Simultan Topographie/Fluoreszenzbild
- Funktionalisieren der Spitze
Nachteile:
- Langsam: Raster Technik (~ 30 min) -> keine Dynamik
- Interaktion mit biologischen Proben
- Nur Oberflächen zugänglich
- Nur glatte Flächen
Wie funktioniert Optofluidic Microscopy? Was ist die Besonderheit? Wie ist der Bezug zur Biologie?
Besonderheit:
- keine Linse
- Probe direkt am Detektor aufgebracht
Funktion:
- Über Detektor Pixeln befinden sich Aperturen, die wesentlich kleiner sind als die Pixel
- > Auflösung nur noch von Aperatur-Größe abhängig
- Bei sehr kleinen Aperaturen -> Auflösung wenig verbessert
- Nur geringer Teil trägt zur Bildentstehung bei
(Je weiter Objekt von Aperatur entfernt, desto schlechter die Auflösung)
- Probe über Array rastern -> Auslösung wesentlich verbessert
(Translation über 2D- oder Fluss über 1D-Array)
Bezug zur Biologie:
- Durchfluss-Systeme mit biologischen Proben
(z. B. C. elegans)
Was verbessert die Konfokal-Mirkoskopie?
Wie ergeben sich die minimalen Abstände?
Was geschiet allgemein mit der psf?
- Verbessert Auflösung, vorallem in z-Richtung (parallel zur optischen Achse)
Allgemein
zmin = 2*λ*n/NA2 (Abstand zum 1. Minimum der Airy-Scheibe)
- Senkrecht zur optischen Achse: d = 0,61*λ/NA
zmin/d > 1
-> Auflösung in z-Richtung schlechter, als in x,y-Richtung
(auch aus Unschärfe Relation ermittelbar)
Bei Konfokal-Mikroskopie: d’HM = 0,18*λ/NA
- Point-spread-function wird entlang der optischen Achse verzerrt (wegen wässirgem Mileu der Probe -> sphäriche Aberration)
- > Helligkeit des Maximums sinkt
Erläutern Sie das Prinzip der Konfokal-Mikroskopie. Was ändert sich in der Probenebene?
- Verwendet Lochblende vor Detektor und nach Lichtquelle
- > Erhöht Auflösung, vorallem in laterale Richtung
- > Nur Signale aus Fokusebene (Keine Hintergrundsignale)
Auflösung in Probeneben bei Konfokal-Mikroskopie:
d’HM = 0,18*λ/NA
- Verbesserung um Faktor 1,4
(Half-Maximum: Breite, bei der noch 50% der Helligkeit des Maximums vorhanden ist)
Was ist der Vorteil von “optical sectioning”?
- Hintergrundsignal aus nicht Fokusebenen ausgeblendet
- Vorallem bei dicken Proben gut
Zwei Effekte:
1) Nicht Fokuspunkte werden auf Grund der Intenstitätsabnahme schwächer beleuchtet (Lochblende nach Lichtquelle)
2) Signal von nicht Fokuspunkten ist breiter und wird an Detektorlochblende unterdrückt
=> point-spread-function ist schärfer
Was ist die gängigste Variante der Konfokalmikroskopie? Was ist das Problem?
Laser Scanning Confocal Microscope
Problem:
- Geringe Zeitauflösung, da jeder Punkt abgerastet werden muss
Erläutern Sie Ansätze um das Grundproblem der Konfokal Mikroskopie zu lösen.
Grundproblem: Geringe Zeitauflösung
1) Schlitz-Konfokal:
- Nicht ein Punkt, sonder Schlitz wird beleuchtet
- Geringer Aufnahmezeit, aber Auflösung schlechter, vorallem in z-Richtung
2) Nipkow-Scheibe:
- Scheibe mit vielen Lochblenden
- Rotation der Scheibe -> Beobachtungsebene wie homogen beleuchtet
- Verbesserte Auflösung bleibt erhalten
Welche Möglichkeiten gibt es die Auflösung von Konfokal Mikroskopie weiter zu verbessern?
psf = psfill * psfdet
- Änderung der psf der Beleuchtung bzw. Detektion
1) 4-π-Mikroskopie: - Objektive beidseitig von der Probe -> Gesamter Raum abgedeckt
- psfill bzw. psfdet sind durch Interferenz beider Lichtstrahlen gegeben
(Gleiche Weglängen, für nutzbare Interferenz)
2) θ-Mikroskopie:
- Detektion im rechten Winkel zur Anregung
- Nur kleines spährisches Volumen, andem sich sowohl Anregungs- als auch Detektions-psf befinden (siehe Bild)
- in Kombination mit 4-π-Mikroskopie, werden axiale Maxima unterdrückt
Erläutern Sie die Methodik von SPIM.
SPIM = Selective Plane Illumination Microscopy
(gut bei dicken Proben)
- Variante der θ-Mikroskopie
- Anregungslicht durch Zylinderlinse als Lichtblatt fokussiert
- > Einzelne Ebenen in z-Richtung anregbar
- > optical sectioning durch Rotation der Probe
(Rekonstruktion mittels Software einach als bei Konfokal Mikroskopie)
Nennen Sie Anwendungen der Konfokal Mikroskopie.
1) Zellbiologie:
- Wegen hoher z-Auflösung gut für ausgedehnte Proben
- Häufig mit fluoreszenzmarkierten Zellen
2) Spektroskopie:
- Detektionsvolumen sollte auf kleinen bereich beschränkt werden
- Vorallem bei einzel Molekül Studien
- Hintergrundssignale effiktiv unterdrückt
3) Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM):
- Bestimmung der Lebensdauer des angeregten Zustands
- Zeitverzögerung zwischen detektiertem Photon und Laserpuls gemessen
- Fluorophore mit verschiedenen Lebensdauern unterscheidbar
- Alternative zu FRET, da sich Lebensdauer durch Energietransfer verringert
(Transfereffizienz bleibt hier während Belichtungsdauer konstant)
Erläutern Sie das Prinzip der Lichtfeld Mikroskopie.
- Neben Position des Strahls am Detektor auch Winkel gemessen
(aber relativ schlechte Auflösung)
- Bestimmung des Winkels durch Array aus Mikrolinsen
- > jede Mikrolinse fokussieren Licht auf bestimmte Detektorfläche
Erläutern Sie die Micro-Optical Sectioning Tomography.
- Hoher Arbteitsabstand bei z.B. Organen ist Auflösungslimitierend
- > Daher Schnitte mikroskopieren
- Hier wird während des schneides die Probe mittels Fluoreszenzmikroskop aufgenommen
- > Ebenenschnitte leichter zueinander in Beziehung zu setzen
- Sehr hohe Aufnahmezeit > 200 h
Erläutern Sie die Zwei-Photonen Mikroskopie.
- Gleichzeitige Absorption zweier Photon mit doppelter Wellenlänge
(Peak-Leistung ≈ 100kW nötig -> gepulstes Lasersystem nötig)
- Fluorophore haben endliche Wahrscheinlichkeit für die Anregung von S0 zu S1
(Meist jedoch λ2,phot < 2*λ1,phot verwendet -> etwas mehr als halbe Energie)
- Qualität der psf (der Beleuchtung) vergleichbar mit Konfokal Mikroskopie
- Bei zusätzlicher Lochblende vorm Detektor -> psf verbessert?
Nennen Sie Vorteile der Zwei-Photonen-Mikroskopie.
1) Geringere Streuung der Infrarot Strahlung in der Probe
- Höhere Eindringtiefe bei dicken Proben
- > dynamische Vorgänge in vivo beobachtbar
- Weniger Anregung außerhalb des Fokusses durch gestreutes Licht
2) Geringes Anregungsvolumen
- Vorallem in z-Richtung
- Keine Bleichung der nicht Fokusebenen
3) psf verbessert
Beschreiben Sie kurz den schematischen Aufbau eines Zwei-Photonen Mikroskops.
- Ähnlich zur Konfokal Mikroskopie
- Femto-Sekunden Laser nötig
- Infrarot-Laser durch Objektiv aus Probe fokussiert
- Dichrotischer Spiegel teilt Anregungs- von Emissionslicht
- Weiterer dichrotischer Spiegel teilt Fluoresznezfarben auf
- > Monochromatoren -> Photomultiplier als Detektoren
Was ist Over- bzw. Underfilling?
Bei Zwei-Photonen Mikroskopie
Overfilling:
- Aperaturebene des Objektivs komplett ausgefüllt
- > scharfer Fokus, aber weniger Anregungsintensität
Underfilling:
- Aperaturebene nicht komplett gefüllt
- > Fokus unschärfer, dafür mehr Intensität
Nennen Sie Anwendungen der Zwei-Photonen Mikroskopie.
1) Deep-Tissue Imaging
- z.B. lebendes Gehirn
- Nahezu gesamte Großhirnrinde mit hoher Auflösung erkennbar
- Signal-Prozesse über z.B. Calcium Imaging sichtbar
2) Zelluläre Interaktionen z.B. im Lymph-Knoten
- Interaktion von T-Zellen mit dendritischen Zellen
Was ist die Bild-Entfaltung?
- Mathematische Methode um Bilder nachzubearbeiten (3D Objekten)
- Nutzt die Eigenschaften der Abbildungsoptik
- > Kontrastreicheres Bild
Wie funktioniert die Bild-Entfaltung?
- Bild ist Faltung des Objekts mit psf
- d.h. FT des Objekts mal FT der psf ergeben Bild
Entfalung:
- Inverse der Faltung
- Bei bekannter psf kann Inverse berechnet werden (iterativer Prozess)
- psf bestimmen, durch Objekt mit bekannter Größe
- > Mit Mikroskop Größe der psf messen
- > Auf andere Objekte anwenden, um wie viel es größer geworden ist
Erläutern Sie die TIRFM.
TIRFM = Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy
Totalreflexion:
- Beim Übergang von Licht aus optisch dichteren Medium (n1) ins optisch dünnere (n2)
(Abhängig vom Winkel; Θc = arcsin(n2/n1))
- Intensität im zweiten Medium nimmt exponetiell ab (evaneszente Welle)
- > Anregung von Fluorophoren nah der Grenzfläche möglich (~ 100 nm)
- > Oberflächensensitive Methode
Was geben die Fresnel-Gleichungen an? Was sind deren Folgen?
(Aus Maxwell-Gleichungen/Elektrodynamik)
- Beschreiben welche Teile (senkrechte/parallele Komponente) des E-Feldes transmittiert bzw. reflektiert werden
Folgen:
- Einfallende und transmittierte Welle haben gleiche Phase
- Reflexion führt zu Phasenverschiebung um π
Was ist der Brewster-Winkel?
Winkel, bei dem nur senkrechte Komponente des E-Feldes reflektiert wird
(parallele Komponente gar nicht reflektiert)
Was sind Vorteile der TIRFM?
TIRFM = Total internal reflection fluorescence microscopy
Vorteile:
- Wegen Energieerhaltung: Evaneszente Welle, welche mit 1/e abfällt (trotz Totalreflexion)
- Geringe Eindringtiefe von ~ 100nm (abhängig vom Winkel und Wellenlänge)
- > kein Stör-/Streulicht aus tieferen Ebenen
- Aber, hohe NA nötig um Winkel für Totalreflexion zu erreichen
Nennen Sie die Anwendung der TIRFM.
TIRFM = Total internal reflection fluorescence microscopy
1) Untersuchung von Proben/Zellen bei denen nur bestimmte Teile relevant sind
z. B. Membranverankerungen von Proteinen oder Vesikelfusion an Membran
2) 3D-Tracking, da Intensität mit Abstand zur Grenzschicht abnimmt
3) Quantifizierung von Bindungsprozessen mit fluoreszierenden Ligand und Rezeptor an Glasplatte
Erläutern Sie kurz das Setup der TIRFM.
TIRFM = Total internal reflection fluorescence microscopy
1) Glas-Prisma
- Beleuchtung von seitlich-oben (mit Winkel für Totalreflexion)
- > Totalreflexion an Grenzfläche vom Prisma zum Deckglas
- > Fluoreszenz von Objektiv aufgenommen
2) Beleuchtung von unten (Immersionsmikroskop)
- Laser nicht paraxial, sondern seitlich am Objektiv
- > Laser tirfft mit Winkel auf Probenfläche
- > Totalreflexion
Vorteil: Proben von oben pipettierbar
Erläutern Sie die HILO-Mikroskopie.
HILO = Highly Inclined and Laminal Optical sheet
- Variante von TIRF und LSM
- Durch Brechung, entsteht dünnes Lichtblatt durch Probe
- > nur Teil angeregt (scanning)
- > höhere Intensität im Lichtblatt durch Verdünnung
- > Bessere Kontrast
- Anregungslaser-Strahl muss nicht so weit von der optischen Achse entfernt werden (siehe Bild a)
- Ähnlich zur θ-Mikrsokopie und SPIM
