4 Pi & STED & RESOLFT

Question 1

Erläutern Sie das Prinzip der STED Mikroskopie.

Answer 1

Stimulated Emission Depletion = STED

• Laser, der zur stimulierten Emission von S₁ zu S₀ anregt
• Kongruiert mit Fluoreszenz Prozess
• Gleiche Wellenlänge wie eingestrahltes Photon
• > Filterbar von Fluoreszenz
• Ring-Form mit weit höhrer Intensität als Fluoreszenz
• > Hohe Quenching-Effizenz am Ring
• > Schmalere Fluoreszenz-psf in der Mitte

Question 2

Wie ändert sich die Auflösung bei einem STED Mikroskop?

Answer 2

mit ζ = I_max/I_S >> 1,

d. h. Intensität des stimulierten Emissions-Laser ist viel höher, als Sättigungs Intensität der Fluoreszenz
- > Quenching (Fluoreszenzlöschung) mit quasi 100% Effizenz
- > Fluoreszenz-psf ist kleiner (genauer lokalisiert), wenn die Intensität des STED Lasers höher ist

(Auflösung in z-Richtung kann auch verbessert werden)

Question 3

Erläutern Sie kurz den schematischen Aufbau eines STED Mikroskops.

Wie wird eine Trennung von Fluoreszenz- und Laser-Licht erreicht?

Answer 3

• Kurzer Anregungslaserpuls
• Kurz danach: Längerer STED-Puls
• Anregung am kurzwelligem Ende des Absorptionsspektrums
• STED, am langwelligen Ende des Emissionsspektrums

=> Fluoreszenz Licht gut von Laser trennbar

(Dichroitische Spiegel oder Monochromaten)

Question 4

Was verbessert die 4-Pi Mikroskopie?

Answer 4

(Numerische Aperatur quasi verdoppelt)

-> Auflösung vorallem in Axiale (z) Richtung verbessert

(besser als Konfokale Mikroskopie)

• z.B. Fluoreszenz Emission strahlt in alle Richtungen ab
• > mehr Photonen eingefangen
• Weglänge beider Pfade muss gleich sein, für nutzbare Interferenz

Question 5

Was ist beim Setup von 4-Pi Mikroskopie von nöten?

Answer 5

• Strahlteiler; reflextiert 50% und transmittiert 50% des Lichts
• > Zwei Lichtstrahlen
• Piezoelektrischer Verschieber
• > Für gleiche Weglänge der Pfade
• Wichtig für konstruktive/desktruktive Interferenz
• Beim Rückweg entseht im Strahlteiler die Interferenz des Emissionslichts

Question 6

Warum wird Kohärentes Licht bei der 4-Pi Mikroskopie benötigt?

Answer 6

• Konstante Phasendifferenz zwischen zwei Wellen und gleiche Frequenz
• > Wichtig für Interferenz

Question 7

Was sind die Vorteile von STED?

Answer 7

1) Auflösung (x,y,z) nicht nur Abhängig von Wellenlänge des Lichts

(Besser, bei höherer STED Laser Intensität)

(Zu hohe Intensitäten schwierig für lebende Zellen)

2) Weniger bleichen der Probe, da bei stimulierter Emission auftritt

Question 8

Was ist Iso-STED? Was ist hier schwieriger als sonst?

Um wie viel wird die Auflösung verbessert?

Answer 8

“Iso-Raum” => 4-Pi-STED Mikroskopie

• Schwierig Weglängen so exakt einzustellen, wie für STED nötig
• Dafür sehr gute Auflösung (Faktor 10-15 besser als Konfokal-Mikroskopie)

Question 9

Erläutern Sie RESOLFT.

Answer 9

RESOLFT = Reversible Saturable Optical (Fluorescent) Transition

Variante davon ist “Ground state deplition” (GSD) microscopy

• Prinzip wie bei STED -> weniger aktive Fluorophore
• > bessere Auflösung
• Fluorophor hat Hell- und Dunkelzustand
• Laser regt ISC zum Dunkelzustand (Triplet) an

(Relaxion in Grundzustand langsam)

• “Blinking microscopy”