serologie Flashcards
SEROLOGIE k čemu je
- Umožňuje nám zjistit patogen pomocí specifických protilátek
- Protilátky se stanovují z krevního séra, likvóru, moči, slin
- Buněčná imunita se využívá v TUBERKULÍNOVÝM TESTU (= test na TBC)
POZITIVNÍ = MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS
-> Červená pokožka
NEGATIVNÍ = BEZ REAKCE
VÝHODY SEROLOGIE
- Sledování odezvy organismu
- Využíváme pro MO, které:
- Nemůžeme kultivovat
- Viry (HBV, vzteklina, coronavirus, EBV, HIV, HCV…
- Někteří paraziti (např. Toxoplasma gondii)
- Atypické bakterie (Mycoplasmy, Chlamydie)
- Spirochety (Treponema palladium, Borellia afzelii/garinii)
- …
- Jsou moc nebezpečné na kultivaci či je kultivace moc náročná
NEVÝHODY SEROLOGIE
- Detekujeme protilátky ne MO
- Organismus nemusí tvořit protilátky
- Protilátky se mohou tvořit i bez MO
- Protilátky jsou v séru dlouho i po prodělané nemoci
- Falešná pozitivita/negativita
PROTILÁTKY mohou být:
o Protein
o Glykopeptid
o Polysacharid
o …
Specifické protilátky (imunoglobuliny):
- IgA
- IgG
- IgM
- IgD
- IgE
IgA
o neutralizuje antigen
o tvořen z 2 podjednotek (z 2 Y)
o na kůži a na sliznici (v potu, mazu, sekretech…)
o vznikají brzy po kontaktu s antigenem
o Dimér (2Y = složený ze dvou podjednotek)
IgE
o důležitý při alergii (alergické reakce)
o paraziti
o monomer
IgM
o veliká molekula
o pentamér = skládá se z 5 podjednotek (z 5 Y)
o neprochází placentou
- průkaz protilátek IgM u novorozence vždycky znamená nitroděložní infekci plodu
o protilátka akutního typu (akutní infekce) teď probíhá nemoc
o Tvoří se jako první po kontaktu s MO
IgG
o Vzniká pozdě
o Monomér (1Y)
o Anamnestické protilátky (rekonvalescenční = po nemoci)
o skládá se z 1 podjednotky, malá molekula, jedna Y
o prochází placentou a chrání děťátko i v prvních 6 měsících života proti infekcím
o Pokud má matka IgG protilátky proti určité nemoci, přejdou placentou do těla miminka a chrání ho i v prvních měsících života
o Dlouhá životnost Je to Ig, který ukazuje již prodělanou nemoc (kdysi či nedávno, ale již je po nemoci)
- Někdy IgG zůstávají i celý život
IgD
o Důležitý pro vývoj imunitního systému
o Uvolnění histaminu
o Monomér (1Y)
IgM+ a IgG- ?
akutní fáze
IgM- a IgG+ ?
anamnestická fáze (rekonvalescence)
IgM- a IgG- ?
nikdy neprodělaná nemoc
IgM+ a IgG+ ?
chronická infekce, pozdní fáze
REAKCE ANTIGENU S PROTILÁTKOU
- Specifická: nevidíme ji
- Nespecifická:
* Změna struktury Ag
* Můžeme makroskopicky pozorovat (něco se např. vysráží)
- Kvalitativně – jestli je přítomna protilátky
- Kvantitativně – jestli je přítomna protilátka a kolik jí je
Vždy potřebujeme k reakci:
- Antigen (Ag)
- Specifickou protilátku (Ab)
- Vehikulum = nosič (ERY, Latex…), medium (roztok 0,8 % NaCl)
ANTISÉRA
Monoklonální Ab
o Jsou stejné (z jedné buňky)
o Rozpoznávají pouze jeden epitop antigenu
o Drahé
o Velmi specifické
Polyklonální Ab
o Trochu pozměněné
o Rozpoznávají (jsou namířené) proti více epitopům určitého antigenu
o Levné
o Z více různých buněk, můžou být různý
Epitop = je malá oblast molekuly antigenu, kterou rozeznávají imunitní receptory
AVIDITA
= síla (pevnost) vazby antigenu
- Afinita vyjadřuje sílu interakce jednoho vazebného místa s jedním antigenem
- Avidita vzrůstá s afinitou jednoho vazebného místa pro jeden antigen a s počtem simultánně se uplatňujících vazebných míst
- Proto může například pentamer IgM, protilátky s deseti vazebnými místy, vázat antigeny s velmi velkou aviditou, ačkoliv afinita jednotlivých vazebných míst bývá malá
- V první fázi infekce je její hodnota nízká
- Vyzrávaní imunitní odpovědi má za následek tvorbu plazmatických buněk, které tvoří protilátky cíleněji a zároveň dochází ke kompetici o antigen
- Protilátky s vyšší afinitou vychytávají antigen snáze a rychleji
- To se v konečném důsledku projeví vzestupem avidity protilátek v pozdější fázi infekce
VYSOKÁ (velká síla vazby) = anamnestické protilátky (rekonvalescentní), pozdější fáze infekce
NÍZKÁ (nízká síla vazby) = protilátky akutní fáze, nevyzrálé protilátky
TITR
= poslední pozitivní ředění
- Kvantitativní
SEROLOGICKÉ TESTY
- AGLUTINACE
- KFR (KOMPLEMENT FIXAČNÍ REAKCE)
- PRECIPITACE
- WESTERN BLOT (WB)
- ELISA
- FLUORESCENČNÍ IMUNOESEJE
Co to je Aglutinace, co vzniká a její dělení
= Ag + Ab -> vznikne nerozpustitelný produkt (aglutinát, je viditelný okem) + čirá tekutina
- Dělíme na:
- Přímá
- Zpětná
- Nepřímá
- Přímá hemaglutinace
- Nepřímá hemaglutinace
- Latexová aglutinace
Aglutinace se může dělat na 2 způsoby:
* Kvalitativní:
- Oko
- Aglutinoskop
- Zkumavka – chuchvalce - Sklíčko – sype se to
- Kvantitativní:
- Např. v séru je koncentrace 1:1800 je to pozitivní, měří se přesné množství vzniklých imunokomplexů
- Media, kde jsou protilátky či antigeny rozpuštěný:
- Fyz. roztok
- Fyz. roztok + pufr (F2PBS)
- Roztok bílkovin (albumin…)
- BSA, HSA - Dextram
TYPY přímé aglutinace
Widalova reakce
* Detekujeme protilátky proti Salmonelle
Wrightova reakce
* Detekujeme protilátky proti Franciselle a Brucelle
Weilova-Felixova reakce
* Detekujeme protilátky proti Listerii
Přímá aglutinace
- Detekujeme přímo protilátky
- Zjišťujeme proti bakteriálnímu onemocnění
- Nepřímý průkaz MO
POZITIVNÍ = VZNIKNE „CHUCHVALEC‘‘ -> AGLUTINÁT
NEGATIVNÍ = BEZ REAKCE
Zpětná aglutinace (=sérotypizace) a její typ
- Hledáme Ag
- Používáme u Salmonelly, E.coli, Shigella
- Určujeme Ag neznámého MO antisérem
Kaufman-Whiteova schéma (všechny kombinace O, H antigenů)
Nepřímá aglutinace
- Antigeny nebo protilátky jsou navázány na pevné částici např. na:
- erytrocytu (hemaglutinace)
- latexu (latexová aglutinace)
druhy nepřímé aglutinace
- Přímá hemaglutinace
- Nepřímá hemaglutinace
- Latexová aglutinace
Přímá hemaglutinace a její typ
- Určujeme protilátky
- Používá se v transfuzní službě (krevní skupiny)
- Antigeny jsou už navázány na ERY samy od sebe (buď vrozeně či po imunizaci) - V MIE se používá na EBV (infekční mononukleóza = Epstein-Barrová virus)
Paul-Brunell reakce
Nepřímá hemaglutinace
- Určujeme protilátky
- Antigeny jsou na ERY navázány druhotně
- „Donutíme‘‘ ERY aby na sebe navázaly Ag
- Používáme proti Shigellám, Záškrtu (Corynebacterium diphtheriae), Tetanickému toxinu, Syphilisu (Treponema palladium hemaglutinace = TPHA)
Latexová aglutinace
- Dokážeme zjistit jaká protilátka či antigen je navázaný na částici
- HLEDÁME Ab -> budeme mít navázaný známý Ag v antiséru
- Revmatoidní faktor (způsobuje revmatoidní arthritis) - HLEDÁME Ag -> budeme mít navázanou známou Ab v antiséru
- Stafylokoky, Meningokoky, Streptokoky, Pneumokoky
KFR (KOMPLEMENT FIXAČNÍ REAKCE) - co to je
- Umožňuje nám určit specifické protilátky
- Neurčí nám typ protilátky (IgM, IgG…)
- Komplex antigen protilátka + komplement
- Používáme beraní ERY = zviditelní nám reakci, abychom dokázali určit, zda je +/-
- Už se nepoužívá
- Dříve používaná na Brucella, Listerie, Mycoplasma pneumoniae, Toxoplasma gondii
co je potřeba ke KFR a výsledek
Skládá se z:
1) AMBOCEPTOR
- Králičí protilátky
- na ně navážeme beraní ERY (hemolytický systém)
- ERY jsou senzibilizované králičími protilátkami
- Beraní ERY + AMBOCEPTOR (=senzibilizace)
2) KOMPLEMENT
- Morčecí či králičí
- Bílkovina
3) ANTIGEN
4) SÉRUM PACIENTA
- Zde hledáme protilátky
- I zde se nachází komplement sérum proto musíme zahřát, abychom se ho zbavili (56C, 30 min)
POZITIVNÍ = čirá jamička se sedimentem ERY
NEGATIVNÍ = červená jamička, hemolýza ERY, protože nenavázaný komplement na ně zaútočí
PRECIPITACE
- Reakce protilátky s antigenem
- Jsou rozpuštěný antigeny
- Při POZITIVNÍ reakci nám vzniká nerozpustná sraženina (=precipitát)
- vysrážení Ag a Ab
- vznikne jen, když je dostatek Ab
- Ag a Ab musí být v optimálním poměru
- Dobrý průkaz antigenu
2 varianty precipitace
- Ve vodním roztoku
- V gelu, agaru
precipitace v roztoku, druhy
a. Prstencová precipitace
- Dělá se v úzké kapilárce
- Dříve se používalo na určení
β-hemolytických streptokoků
POZITIVNÍ = UTVOŘÍ SE PRSTENEC (SRAŽENINA)
NEGATIVNÍ = BEZ REAKCE
b. Flokulace
- Využívalo se dříve na ředění bakteriálních titrací toxínů
- Už se nedělá
- Smíšením roztoku antigenu a protilátky dochází k vysrážení v podobě vloček (= vyvločkování)
precipitace v gelu, druhy
a. Technika dle OUCHTERLONYHO = KVALITATIVNÍ METODA
- Vylejeme gel
- Uděláme dírky kovovou tyčí a ty vyplníme Ag a Ab (dle obrázku)
- Ag a Ab jdou proti sobě a tam kde se střetnou se utvoří precipitační linie (viditelné sraženiny)
b. Imunodifúze dle Manciniové = KVANTITATIVNÍ METODA
- V každé jamičce jiné množství Antigenu
- Okolo které jamky nám vznikne prstenec = POZITIVNÍ
- Čím větší prstenec = tím více Ag
- Vzniklý prstenec dále měříme speciálním pravítkem
WESTERN BLOT (WB)
- Využíváme na stanovení:
o Borellií
o Toxoplasma gondii
o HIV - Dokážeme určit přesný MO
- Umíme určit všechny typy Ag a dokážeme zjistit jaký typ přesně
- Dokážeme určit protilátky proti mnohočetným MO
WESTERN BLOT (WB) - co tam patří
- Elektroforéza
- Podle hmotnosti a velikosti se bílkoviny (MO) rozdělí po celé ploše gelu
- Elektrický proud nám tahá bílkoviny dolů
- Přístroj = plastové destičky, které mají mezi sebou gel (nesmí vyschnout!!)
- V podstatě nám rozdělí MO na menší kusy - Strip
- Pacientovo sérum s jeho protilátkami se nakape na proužek
- Dělá se při potvrzení HIV, Toxoplasmy
- Vazba Ag s Ab na určitých úsecích stripu = BAREVNÉ PRUHY (+)
ELISA
KVANTITATIVNÍ METODA
- Serologická metoda, při které prokazujeme antigen či protilátku
- Na dně jamičky je navázaný Ab či Ag (záleží, co chceme zjistit)
[co chceme zjistit] + králičí protilátky = BAREVNÁ JAMKA (ŽLUTÁ)
- U většiny typů (kromě kompetitivní ELISY) platí to, že čím více navázaných pacientovo protilátek = tím více zbarvená jamička
- Dokážeme určit i typ protilátky (IgM, IgG…)
- Existuje i robotizovaná ELISA = drahá údržba i přístroj
- Dokážeme vyšetřit více pacientů najednou
- Bezpečná a spolehlivá metoda
druhy ELISY
- Přímá ELISA
- Nepřímá ELISA
- Sandwichová ELISA
- Kompetitivní ELISA
Přímá ELISA
- Málo specifická reakce
- Moc se nepoužívá
Y = specifická protilátka
* = enzym navázaný na protilátce
- Máme jamičku, kde je na dně navázaný antigen
- Do jamičky přidáme specifickou protilátku pacienta s navázaným enzymem = ta se naváže na antigen
- Poté přidáme do jamičky substrát = enzym substrát natráví a vznikne barevný komplex (substrát nám barvu a tím pádem i reakci zviditelní)
POZITIVNÍ = BAREVNÁ (ŽLUTÁ) JAMIČKA
Nepřímá ELISA
Y - primární protilátka = pacientovo
Y2 - sekundární protilátka = králičí
* - enzym navázaný na protilátce
- enzym substrát natráví a vznikne barevný komplex (substrát nám barvu a tím pádem i reakci zviditelní)
POZITIVNÍ = BAREVNÁ (ŽLUTÁ) JAMIČKA
Sandwichová ELISA
- Velmi používaná
- Vysoce specifická a spolehlivá
- Nejčastější ELISA
Y = primární protilátka = pacientovo
Y2 = sekundární protilátka = králičí
* = enzym navázaný na protilátce
- Máme jamičku, kde je na dně navázaný antigen
- Do jamičky se poté přidá primární protilátka (pacientovo)
- Poté se přidá sekundární protilátka (králičí) s navázaným enzymem
- Poté se přidá substrát = enzym substrát natráví a vznikne barevný komplex (substrát nám barvu a tím pádem i reakci zviditelní)
POZITIVNÍ = BAREVNÁ (ŽLUTÁ) JAMIČKA
Kompetitivní ELISA
- Protilátky proti sobě ,,soutěží‘‘
Y = primární protilátka = pacientovo
Y2 = sekundární protilátka = králičí mají větší afinitu k Ag - = enzym navázaný na protilátce
- Zde platí, že vím více je naváže pacientovo protilátek tím menší zbarvení jamičky
- ASI? = na pacientovo protilátkách není navázaný enzym (ten je na sekundárních protilátkách), proto když je víc navázaných pacientovo protilátek -> tím pádem je navázáno méně enzymu a protože enzymu tráví substrát jamička se zbarví MÁLO
(+) = BEZBARVÁ JAMIČKA
(-) = BAREVNÁ JAMIČKA
FLUORESCENČNÍ IMUNOESEJE
- Používá se fluorescenční mikroskop
- Musí být tma
- Hledá se protilátka, ale dají se hledat i antigeny
- Např. pro Coxsackie, Treponema palladium
- Přímá
Y = protilátka pacienta
* = fluorescenční barvivo - Nepřímá
Y = sekundární protilátka
Y2 = protilátka pacienta
* = fluorescenční barvivo
