hemarna Flashcards
Počítaní erytrocytů - princip
- Ve dvěstěnásobně zředěné krvi se stanoví počet červených krvinek v 1 mikrolitru sedimentovaných na známou plochu mřížky dna komůrky o známém objemu
Počítaní erytrocytů - reagencie
- Hayemův roztok
Počítaní erytrocytů - postup
- Do zkumavky se připraví pipetou o obsahu 4975 ul Hayemův roztok
- Nasaje se krev (venózní po 3 minutovém roztřepání na třepačce, kapilární přímo z prstu) do mikropipety o obsahu 25 ul a promíchá se
- Nechá se stát při pokojové teplotě
- Na čistou, suchou, tuku zbavenou Bürkerovu komůrku se připevní čisté, tuku zbavené zabroušené krycí sklo přímo nebo svěráky tak, aby vznikly pod sklíčkem na postranních nosných plochách komůrky viditelné Newtonovy kruhy
- Obsah zkumavky se 3 minuty protřepe na třepačce
- Aspiruje se kapilárou, která se pak přiloží k okraji krycího skla
- Komůrka se naplní kapilaritou tak, aby tekutina nepřetékala do okrajových rýh
- Po 3 minutách stání, při pokojové teplotě, se zjišťuje počet červených krvinek ve 20 obdélnících mřížky komůrky rozdělených po celé její ploše
- Počítají se všechny krvinky, které se jakkoli dotýkají dvou sousedních stran obdélníku (zevně), nepočítají se ty, které se dotýkají zbylých dvou stran protilehlých (i zevnitř)
- Výsledná hodnota se dělí 100 a uvádí se s koeficientem 1012 / l
Počítaní erytrocytů - hodnoty
ŽENY - 3,8 - 5,2 10(12)/l
MUŽI - 4,0 - 5,8 10(12)/l
Počítaní erytrocytů - ZVÝŠENÉ
SEKUNDÁRNÍ POLYGLOBULIE, POLYCYTÉMIE VERA
Počítaní erytrocytů - SNÍŽENÉ
ANÉMIE (NAPŘ. HEMOLYTICKÉ, APLASTICKÉ)
Vyšetření krevní skupiny (sklíčko) - PRINCIP
- princip spočívá v reakci antigen – protilátka, kdy vyšetřujeme antigen na erytrocytu v kapce krve na sklíčku pomocí známých protilátek v diagnostických sérech
Vyšetření krevní skupiny (sklíčko) - REAGENCIE
- diagnostická séra:
Anti – A
Anti – B
Počítání leukocytů - PRINCIP
- Ve dvacetinásobně zředěné krvi po hemolýze červených krvinek se stanoví počet bílých krvinek v 1 mm3 (ul) sedimentovaných na známou plochu mřížky dna komůrky o známém objemu
Počítání leukocytů - REAGENCIE
- Türkův roztok
Počítání leukocytů - POSTUP
- Do zkumavky se připraví pipetou o obsahu 475 ul Türkova roztoku
- Nasaje se krev (venózní po 3 minutovém roztřepání na třepačce) do mikropipety o obsahu 25 ul a promícháme
- Nechá se stát při pokojové teplotě
- Na čistou, suchou, tuku zbavenou Bürkerovu komůrku se připevní čisté, tuku zbavené zabroušené krycí sklo přímo nebo svěráky tak, aby vznikly pod sklíčkem na postranních nosných plochách komůrky viditelné Newtonovy kruhy
- Čistíme líhem - Obsah zkumavky se protřepe 3 minuty na třepačce
- Aspiruje se kapilárou, která se pak přiloží k okraji krycího skla
- Komůrka se naplní kapilaritou tak, aby tekutina nepřetékala do okrajových rýh komůrky
- Po 3 minutách stání, při pokojové teplotě, se počítají leukocyty v komůrce v
50 STŘEDNÍCH ČTVERCÍCH
- Počítá se v celé ploše mřížky
- Doporučuje se úhlopříčný postup, při němž se zjistí počet leukocytů ve 48 čtvercích a k nim se přidá počet ze dvou čtverců uložených ve středu
- Může se rovněž počítat příčným směrem zleva doprava nebo shora dolů
- Výsledek se dělí 10 a uvádí se s koeficientem 109/l
Počítání leukocytů - HODNOTY
4,0 - 10,0 X 10(9)/l
Počítání leukocytů - ZVÝŠENÉ
LEUKOCYTÓZA = INFEKCE, NÁDOROVÉ ONEMOCNĚNÍ, POPÁLENINY, LEUKÉMIE
Počítání leukocytů - SNÍŽENÉ
LEUKOCYTOPÉNIE = DŘEŇOVÉ ÚTLUMY
Vyšetření krevní skupiny (AGLUTINÍNY) - PRINCIP
- Přítomnost přirozených pravidelných aglutininů anti-A, anti-B se vyšetřuje pomocí známých typových krvinek
- Princip spočívá v reakci antigen protilátka, kdy neznámou protilátku (v séru vyšetřovaného vzorku) vyšetřujeme pomocí známého antigenu (typové krvinky)
Vyšetření krevní skupiny (AGLUTINÍNY) - reagencie
- ZNÁMÉ TYPOVÉ KRVINKY:
O
A1
A2
B
Vyšetření krevní skupiny (AGLUTINÍNY) - vzorek
- SÉRUM pacienta
Vyšetření krevní skupiny (AGLUTINÍNY) -POSTUP
- Do stojánku si připravíme:
o 4 aglutinační zkumavky označené číslem vyšetření a označením 0, A1, A2, B - Do každé zkumavky kápneme 2 kapky vyšetřovaného séra
- Do příslušné zkumavky přidáme 1 kapku příslušných typových ERY
- Zkumavky protřepeme a centrifugujeme 1000 ot. / 1 min
- Poté se na zkumavky podíváme a zkusíme rukou jemným pohybem zkumavky oddělit aglutinát ode dna zkumavky
- Odečítáme MAKROSKOPICKY
!!POKUD VYJDE SKUPINA A NEBO AB DĚLÁME VYŠETŘENÍ NA PODSKUPINU A1 A A2!!
Stanovení hemoglobinu - PRINCIP
- Hemoglobin se transformačním roztokem uvolní z erytrocytů, převede se ve stálý hemiglobinkyanid a zředí se
- Stanoví se absorbance tohoto roztoku a výsledek se vypočítá ze vzorce
Stanovení hemoglobinu - REAGENCIE
- Drabkinův roztok (JEDOVATÝ KVŮLI OBSAHU KYANIDU DRASELNÉHO)
Stanovení hemoglobinu - POSTUP
- Do zkumavky se napipetuje 7 mi, popř. 5,6 ml transformačního roztoku
- Pomocí kapilární mikropipety se do roztoku přenese kvantitativně 25 mm3(ul), popř. 20 mm3(pl) vyšetřované krve
- Obsah zkumavky se ihned promíchá dvojím obrácením
- Roztokem ferrikyanidu draselného se hemoglobin oxiduje na hemoglobin (methemoglobin) a ten se potom pomocí kyanidu draselného přemění na hemiglobinkyanid
- Tento roztok má hnědě červenou barvu, vhodnou pro fotometrické stanovení protože barevný komplex je stabilní - Za 15-20 minut se zjistí fotometrem absorbance roztoku (Avz)
- Měří se při vlnové délce 540 nm při síle kyvety 1 cm
- Jako blank se používá transformační roztok
- Dále se změří hodnota absorbance standardního roztoku (Ast) Jeho koncentrace je udána od výrobce (Cst)
Stanovení hemoglobinu - HODNOTY
Ženy = 120 –165 g/l
Muži = 130 –175 g/l
Stanovení hemoglobinu - ZVÝŠENÉ
POLYCYTÉMIE VERA, SEKUNDÁRNÍ POLYGLOBULIE, DEHYDRATACE, POBYT V NADMOŘSKÝCH VÝŠKÁCH
Stanovení hemoglobinu - SNÍŽENÉ
ANÉMIE
Vyšetření krevní skupiny (AGLUTINOGENY) - PRINCIP
- Antigenní vlastnosti ABO erytrocytů se vyšetřují pomocí známých diagnostických sér anti-A, anti-B, anti-AB
- Princip spočívá v reakci antigen – protilátka, kdy neznámý antigen (na krvince) vyšetřujeme pomocí známé protilátky (v diagnostickém séru)
Vyšetření krevní skupiny (AGLUTINOGENY) - REAGENCIE
- Diagnostická séra:
anti-A
anti-B
anti-AB
Vyšetření krevní skupiny (AGLUTINOGENY) - VZOREK
- KREV pacienta (ze suché kapky děláme náplav)
Vyšetření krevní skupiny (AGLUTINOGENY) - POSTUP
- Připravíme se aglutinační zkumavky
- 3 zkumavky = označíme si je -AB, -B, -A a číslo vzorku
- 1 obyčejnou zkumavku na náplav - Připravíme si náplav ERY
- suchá kapka do zkumavky, promýt v nadbytku fyz.roztoku, 3000ot/3min 3X - Do každé připravené zkumavky kápneme 1 kapku příslušného diagnostického séra (dle označení)
- Dále přidáme 1 kapku ERY
- Zkumavky promícháme a centrifugujeme 2500ot/20s
- Odečítáme výsledek makroskopicky, jemným pohybem ruky oddělíme aglutinát ode dna zkumavky
Pokud vyjde skupina A nebo AB děláme vyšetření na podskupinu A1 a A2
Stanovení hematokritu - PRINCIP
- Stanovení procentuálního poměru mezi objemem erytrocytů, popř. i ostatních buněčných součástí krve a objemem plazmy
Stanovení hematokritu - POSTUP
- Kapilára se naplní krví do 4/5 celkové kapilární délky
- Nenaplněný konec se utěsní tmelem nebo se zataví nad svíčkou
- Kapiláry se vloží do centrifugy ve vasermanově zkumavce a kapiláru dáme do zkumavky zataveným koncem ven
- Po centrifugaci se odečítá hodnota na speciálním měřítku (3000 ot/min) 3’
* Kapiláry se do něj vloží tak, aby spodní hranice sloupce erytrocytů byla na 0 (na dolní rysce)
* Horní hranice se vyrovná s ryskou na rameni posuvného měřítka
* Kapilárou se posune, až se meniskus plazmy protne s ryskou na rameni posuvného měřítka
* Hodnota se odečte na stupnici, převede se na setiny
* Kapilárou se posunuje, až se meniskus plazmy dostane na 100
Stanovení hematokritu - HODNOTY
Ženy 0,35 – 0,45 (35% - 45%)
Muži 0,40 – 0,54 (40% - 54%)
Stanovení hematokritu - ZVÝŠENÉ
DEHYDRATACE
Stanovení hematokritu - SNÍŽENÉ
ANÉMIE
Vyšetření Rh faktoru - PRINCIP
- Vlastnost Rh (D) - přítomnost antigenu D na erytrocytu prokazujeme pomocí známých
- diagnostických sér anti - D.
- Princip spočívá v reakci antigen – protilátka, kdy prokazujeme přítomnost nebo nepřítomnost antigenu D pomocí známé protilátky
Vyšetření Rh faktoru - REAGENCIE
- anti D IgM - (Anti D1)
- anti D mix IgM+IgG- (anti D2)
- Kontrolní reagencie Rh negativní kontrola (NK)
Vyšetření Rh faktoru - VZOREK
KREV pacienta (3-5% náplav erytrocytů)
Vyšetření Rh faktoru - POSTUP
1) Připravíme si zkumavky
- 3 zkumavky = Anti D / Anti D mix / NK
2) Do každé zkumavky dáme 1 kapku séra a 1 kapku vyšetřovaných ERY (náplav)
3) Zkumavky protřepeme a centrifujujeme 1min/1000ot
4) Odečítáme makroskopicky nejprve mírným nakloněním zkumavky, kdy u negativních výsledků stékají ERY jako pramínek po jejím dně
- Aglutinát oddělíme ode dna zkumavky jemným pohybem
- Negativní výsledky KONTROLUJEME V MIKROSKOPU
!!!! Je-li výsledek vyšetření Rh negativní je nutné provést vyšetření slabé formy Rh antigenu (Rh week)
Vyšetření Rh faktoru - KONTROLY
- Ke každému souboru vyšetření se provádějí pozitivní a negativní kontroly ke každému
- diagnostickému séru (anti -D1, artn-D2), použijí se typové krvinky s předem známým Rh faktorem.
- Postup je stejný, jako u vyšetření neznámého vzorku
- Kontroly se odečítají vždy jako první
NEGATIVNÍ KONTROLA (NK) = musí dát vždy negativní výsledek
- Používá se k detekci spontanní aglutinace, tj. k eliminaci falešně pozitivních výsledků
- Dojde – li v tomto případě k aglutinaci vyšetřovaných erytrocytů = výsledek nelze interpretovat
Sedimentace erytrocytů - PRINCIP
- Numerická hodnota v mm se získá měřením vzdálenosti mezi nejnižším bodem povrchového menisku a horním okrajem sedimentu erytrocytů ve sloupci z nesrážlivé zředěné krve, která stála ve svisle postavené rource po dobu 60 minut
- Tento empirický fenomén závisí na vzájemných vztazích proměnných (hladina hemoglobinu, věk, pohlaví, menstruačnícyklus nebo těhotenství u žen,užívané léky, teplota prostředí apod.)
- Sedimentace může probíhat při teplotách 4‘C, 20‘C a 37‘C.
Sedimentace erytrocytů - POSTUP
- Krví se naplní čistá, suchá, standardní sedimentační rourka po značku 0
- Pak se rourka postaví do příčně svislé polohy v pokojové teplotě (18-25 “C) bez vystavení přímému slunečnímu světlu, vibracím a prúvanu
- Odečítáme po 1h a po 2h
- Po uplynuti 60 minut se odečítá vzdálenost v mm od dolního pólu povrchového menisku k vrcholu sloupce sedimentovaných erytrocytů (Vrstva bílých krvinek se nepočítá)
- Udává se v mm/hod. jako hodnota sedimentace erytrocytů (SE nebo FW FW podle Fahraeuse a Westergrena ).
Sedimentace erytrocytů - HODNOTY
ZA 1 HODINU =
MUŽI 3-9 mm
ŽENY 7-12 mm
ZA 2 HODINY =
MUŽI 6-20 mm
ŽENY 14 - 28 mm
Sedimentace erytrocytů - ZVÝŠENÁ
Bakterie, viry, chronické záněty, poškození jater, chudokrevnost, nádorová onemocnění. Důležitý je také věk (nad 60 let se mohou objevit zvýšené hodnoty až do 30 milimetrů za hodinu, aniž by byl člověk nemocen)
Sedimentace erytrocytů - SNÍŽENÁ
přítomnost zánětu v těle. zvýšená hladina fibrinogenu v krvi. zvýšená hladina hematokritu v krvi
Antigeny C, c, E, e - PRINCIP
- Erytrocytární antigeny C, c, E, e se vyšetřují pomocí diagnostických sér obsahujících známou protilátku anti-C, anti-c, anti-E, anti-e
- Princip spočívá v reakci antigen – protilátka, kdy neznámý antigen (na krvince) vyšetřujeme pomocí známé protilátky (v diagnostickém séru)
Antigeny C, c, E, e - REAGENCIE
- Testovací séra:
Anti – C
Anti – c
Anti – E
Anti – e
Antigeny C, c, E, e - POSTUP
- Připravíme si náplav ERY (3-5% suspenze ERY)
- Připravíme si zkumavky
- 4 zkumavky popsaných dle antisér (anti C, anti c, anti E, anti e)
- Kontroly (2x = pozitivní a negativní) - Do každé zkumavky dáme 1 kapku séra a 1 kapku vyšetřovaných ERY
- Dobře promícháme a dáme centrifugovat (2500ot/20s)
- Odečítáme makroskopicky jemným poklepem na dno zkumavky
- Jako první se odečítají kontroly
- V PŘÍPADĚ NEGATIVNÍHO VÝSLEDKY INKUBUJEME 10 – 20min PŘI POKOJOVÉ TEPLOTĚ, ZNOVU CENTRIFUJUJEME A MAKROSKOPICKY ODEČÍTÁME
MCV - VÝPOČET
HTC . 10 (3) / RBC
MCHC - VÝPOČET
HGB / HTC
MCH - VÝPOČET
HBG / RBC
D week - PRINCIP
- Slabě vyjádřená vlastnost D se vyšetří pomocí nepřímého antiglobulinového testu diagnostickým sérem anti D-duo
- Princip spočívá v reakci antigen – protilátka, kdy se v tomto případě jedná o slabou formu antigenu a proto je třeba umožnit navázání pratilátky na tento antigen pomocí inkubace (dochází k senzibilizaci erytrocytů) a následně je třeba reakci zviditelnit pomocí antiglobulinového séra
D week - REAGENCIE
- Diagnostické sérum anti-D MlX
- sérum AGH
- pozitivní a negativní kontrolní erytrocyty
- Checkcells CCC (senzibilizované kontrolní erytrocyty pro Coombsovy testy)
D week - VZOREK
- Vyšetřovaný vzorek (3-5% náplav erytrocytů)
D week - POSTUP
- Připravíme si náplav ERY (3000ot/3minuty 3x)
- Připravíme si zkumavky
- 1 zkumavku = anti D mix
- 1 zkumavku na náplav
- 2 zkumavky = kontroly (pozitivní a negativní) - Do každé zkumavky kápneme 1 kapku diagnostického séra a přidáme 1 kapku náplavu vyšetřovaných ERY
- Promícháme a inkubujeme 15 minut při 37 C
- Promyjeme v nadbytku FR (3-5x) 3000ot/3min
- Přidáme 2 kapky séra AGH a řádně promícháme
- Centrifugujeme 2500ot/20s
- Odečítáme makroskopicky mírným houpáním zkumavky
KE VŠEM NEGATIVNÍM VÝSLEDKŮM PŘIDÁME 1 KAPKU CHECHCELLS, PROMÍCHÁME A CENTRIFUGUJEME 1MIN/2000OT VÝSLEDEK MUSÍ BÝT VŽDY POZITIVNÍ
Příprava krevního nátěru - PRINCIP
- Spočívá v mikroskopickém vyšetření krvinek a dalších složek krve získaných z tenkého krevního nátěru. Tento diagnostický postup umožňuje lékařům a laborantům získat informace o složení krve a identifikovat různé abnormality nebo patologie.
- Principem je zhotovení jednovrstvého filmu buněk na podložním sklíčku určeno k mikroskopovaní
Screening protilátek (NAT) - PRINCIP
- Pomocí nepřímého antigtobulinového testu prokazujeme v séru přítomnost (nebo nepřítomnost) volné inkompletní protilátky
Screening protilátek (NAT) - REAGENCIE
- Panoscreen – screeningové krvinky R1 + R2 (dvě lahvičky), nebo R1 R2 (jedna lahvička}
- AGH sérum
- Checkcells
Screening protilátek (NAT) - VZOREK
- SÉRUM pacienta
Screening protilátek (NAT) - POSTUP
- Připravíme si zkumavky
- 2 zkumavky = R1 a R2 - Do každé zkumavky dáme 2 kapky vyšetřovaného séra a 1 kapku R1/R2
- Promícháme a necháme 1 hodinu inkubovat v termostatu (1 hod/37 stupňů)
- Poté hodnotíme přítomnost hemolýzy v supernatanu, poté zkusíme jemně protřepat zda není viditelná anglutinace (I MIKROSKOPICKY) = u kompletních prl. je pozitivní)
- Když nic nevidíme = promyjeme obsah zkumavek 3-5x v nadbytku FR
- Přidáme 2 kapky AGH, promícháme a centrifugujeme 1000ot/1min
- Výsledky hodnotíme makroskopicky, všechny NEGATIVNÍ I MIKROSKOPICKY
SPRÁVNOST VŠECH NEGATIVNÍCH VÝSLEDKŮ KONTROLUJEME PŘIDÁNÍM 1 KAPKY SENZIBILIZOVANÝCH KRVINEK CHECKCELLS
- Promícháme a centrifugujeme 1min/2000ot
- Výsledek musí být vždy POZITIVNÍ = aglutinace
- V opačném případě je test neplatný́ a vyšetření se musí opakovat
Screening protilátek (E) - PRINCIP
- Pomocí enzymatického testu dokazujeme v séru přítomnost (nebo nepřítomnost) volné inkompletní protilátky
- Jde o reakci antigen – protilátka
Screening protilátek (E) - REAGENCIE
- Panoscreen – screeningové krvinky R1+R2 (dvě lahvičky), nebo R1 R2 (jedna lahvička)
- Bromelin
Screening protilátek (E) - VZOREK
- SÉRUM pacienta
Screening protilátek (E) - POSTUP
- Připravíme si zkumavky
- 2 zkumavky R1 a R2 - Do zkumavek přidáme 2 kapky vyšetřovaného séra a 2 kapky screeningových krvinek a
1 kapku bromelinu - Zkumavky promícháme a necháme inkubovat 15 – 20 min při pokojové teplotě
- Centrifugujeme 1min/1000ot
- Hodnotíme přítomnost hemolýzy v supernatanu, poté jemně prostřepeme a hodnotíme přítomnost aglutinace makroskopicky (I MIKROSKOPICKY)
Barvení krevních roztěrů - PRINCIP
- Souprava obsahuje roztoky k rychlému barvení krevních nátěrů. Výsledné vybarvení má panoptický charakter. Barvení se provádí ponořováním do barvících roztoků. Intenzivita a odstín vybervení se dá podle potřeby snadno měnit počtem ponoření.
Barvení krevních roztěrů - POSTUP
- Fixace v methanolu (5 x 1s)
- Kyselé barvení v Eosinu Y (3 x 1s)
- Zásadité barvení v Azuru II (6 x 1s)
- Opláchnutí ve stabilizačním pufr (PBS)
- Poté necháme usušit a hodnotíme
Barvení krevních roztěrů - REAGENCIE
barvící souprava Leukodif (Pliva Lachema a.s.)
- methanol
- eosin
- azur II
- stabilizační pufr (PBS)
Vyšetření podskupiny A1 a A2 - PRINCIP
- Princip spočívá v reakci antigen – protilátka, kdy neznámý antigen (na krvince) vyšetřujeme pomocí známé protilátky (lektin)
- Podskupiny A vyšetřujeme tehdy, když jsme při vyšetřování krevní skupiny zjistili krevní skupinu A nebo AB
- Vyšetření podskupin se provádí pomocí diagnostických sér (lektinů) anti- A, anti- H
Vyšetření podskupiny A1 a A2 - REAGENCIE
- Diagnostická séra (Lektiny):
anti – A
anti - H
Vyšetření podskupiny A1 a A2 - VZOREK
- KREV pacienta (náplav)
Vyšetření podskupiny A1 a A2 - POSTUP
- Připravíme si náplav ERY
- Připravíme si zkumavky
- 2 zkumavky (A1 a H + číslo vzorku)
- Kontroly (pozitivní a negativní) - Do každé zkumavky dáme 1 kapku diagnostického séra a 1 kapku vyšetřovaných ERY (u kontrol typových krvinek)
- Zkumavky promícháme a centrifugujeme 1000ot/1min
- Aglutinát oddělíme ode dna jemným poklepem na její dno
- Odečítáme makroskopicky
Identifikace (E) - PRINCIP
- Pomocí sady suspenzí erytrocytů s předem známými antigeny identifikujeme v séru prostřednictvím antiglobulinového a enzymatického testu konkrétní protilátku
- Reakce antigen - protilátka
Identifikace (E) - REAGENCIE
- Panocell (= makropanel typové panelové krvinky s 10 - 16 lahvičkami obsahujícími erytrocytární suspenzi s erytrocyty nesoucími předem známé antigeny)
- Bromelin
Identifikace (E) - VZOREK
- SÉRUM pacienta
Identifikace (E) - POSTUP
- Připravíme si zkumavky
- 16 zkumavek a označíme si je (1-16)
- 1 zkumavku na kontrolu - Do každé zkumavky kápneme 2 kapky vyšetřovaného séra, 2 kapky typových ERY a
1 kapku bromelinu
- Do zkumavky na kontrolu = 2 kapky autologních ery a 1 kapku bromelinu - Zkumavky promícháme a inkubujeme 15 minut při pokojové teplotě
- Zkumavky centrifugujeme 1min/1000ot
- Odečítáme event. přítomnou hemolýzu (zaznamenáme do protokolu) a hledáme aglutinaci
- Odečítáme MAKROSKOPICKY, VŠECHNY NEGATIVNÍ VÝSLEDKY MIKROSKOPICKY
Diferenciál leukocytů - PRINCIP
- Principem je rozpočet jednotlivých typu leukocytu na jednovrstvém, obarveném krevní nátěru pomoci mikroskopu
Diferenciál leukocytů - POSTUP
- Vezmeme si barvený krevní nátěr
- Pozorujeme pod mikroskopem za použití imerzního objektivu při zvětšení 1000x (dáme imerzní olej)
- Počítáme 100 leukocytů pro určení diferenciálu
- Jednotlivé typy leukocytů zaznamenáváme pomocí leukomatu (ten po spočítání 100 buněk zapípá)
- Poté jednotlivě projíždíme jednotlivé typy buněk napočítáné v leukomatu, které se nám ukážou v procentech
Diferenciál leukocytů - POČET BUNĚK
- Neutrofily – segmenty (NEU): 50–70 %
- Neutrofily – tyče (BAND): do 5%
- Eozinofily (EOS): 1–3%
- Bazofily (BAS): 0–1%
- Monocyty (MONO): 3–8%
- Lymfocyty (LYMF): 24–40 %
Titr protilátky - PRINCIP
- Spočívá v reakci antigen-protilátka, kdy se v tomto případě vyšetřuje aglutinační účinnost séra při jeho postupném ředění geometrickou řadou
- Maximální zředění séra, při kterém ještě nastává aglutinace, vyjadřuje titr aglitininů (protilátky) příslušného séra
- Patří k nejdůležitějším imunohematologickým vyšetřením, kdy se sérum vyšetřuje na množství přítomných aglutininů (protilátek)
- Jedná se o kvantitativní vyšetření protilátky, které provádíme po její identifikaci.
Titr protilátky - REAGENCIE
- Panocell (makropanel, typové erytrocyty nesoucími předem známé antigeny)
- event. i AGH, Checkcells / Bromelin
Titr protilátky - postup
- Připravíme si a označíme zkumavky
- 10 zkumavek (1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32, 1:64, 1:128, 1:256, 1:512, 1:1024) + číslo vzorku - Od zkumavky č.2 (1:4) napipetujeme do všech zkumavek pipetou 100ul fyziologického roztoku
- Do zkumavky č.1 (1:2) a č.2 (1:4) napipetujeme 100ul vyšetřovaného séra
- Od zkumavky č.2 (1:4) rozpipetujeme geometrickou řadou po 100ul
- Poté napipetujeme 100ul typových ERY a promícháme
= titr vyšetřujeme za stejných podmínek jako jsme identifikovaly protilátku
ENZYMATICKY =
6. Zkumavky promícháme a inkubujeme 15 minut při pokojové teplotě
7. Zkumavky centrifugujeme 1min/1000ot
8. Odečítáme event. přítomnou hemolýzu (zaznamenáme do protokolu) a hledáme aglutinaci
9. Odečítáme MAKROSKOPICKY, VŠECHNY NEGATIVNÍ VÝSLEDKY MIKROSKOPICKY
NAT =
1) Zkumavky promícháme a inkubujeme 20 min při pokojové teplotě
2) Centrifugujeme 1min/1000ot
3) Odečítáme event. přítomnou hemolýzu (zaznamenáme do protokolu) a hledáme aglutinaci, a když je zaznamenáme do protokolu a jemně roztřepeme
4) Zkumavky inkubujeme 1h, 37C
5) Odečítáme event. přítomnou hemolýzu (zaznamenáme do protokolu) a hledáme aglutinaci, a když je zaznamenáme do protokolu
6) Obsah všech zkumavek promyjeme 3x v nadbytku fyz.roztoku
7) Do každé zkumavky přidáme 2 kapky AGH a promícháme
8) Centrifugujeme 1min/1000ot
9) Vyhodnocujeme MAKROSKOPICKY, NEGATIVNÍ I MIKROSKOPICKY
- Hodnotíme makroskopicky, negativní výsledky mikroskopicky
- Zapisujeme do předem připravené tabulky, makroskopicky modře, mikroskopicky červeně.
- Hodnota titru je identická s hodnotou ředění ve zkumavce, ve které byla ještě zachycena mikroskopická aglutinace na +
- KONTROLUJEME V MIKROSKOPU
Hodnotíme dle této tabulky:
++++ = aglutinace viditelná pouhým okem ve zkumavce, nebo hrubé shluky
v nátěru na sklíčku
+++ = velké shluky viditelné mikroskopicky (bez volných ery)
++ = smíšené aglutinační pole
+ = několik malých shluků aglutinovaných ery v zorném poli
neg = žádná aglutinace, ery volně rozptýleny
Vyšetření retikulocytů
- Retikulocyt je vývojové stádium erytrocytu. Jedná se o bezjadernou buňku kulovitého tvaru, která obsahuje zbytky některých buněčných organel. Retikulocyt postupně mění svůj tvar na bikonkávní, zbavuje se buněčných organel a tím dozrává v erytrocyt
- Většina retikulocytů se nachází v červené kostní dřeni, periferní krev zdravého dospělého člověka obsahuje retikulocyty v množství 0,5–1,5 % z celkového počtu erytrocytů
- Zvýšený počet retikulocytů v periferní krvi se označuje jako retikulocytóza, která se většinou objevuje při vystupňované erytropoeze.
Vyšetření retikulocytů - PRINCIP
- Zjištění výskytu mladých erytrocytů s retikulofilamenózní substancí - retikulocytů
Vyšetření retikulocytů - REAGENCIE
- Roztok brilant-krezylové modři od firmy Labortechnik KABE
Vyšetření retikulocytů - VZOREK
KREV
Titr protilátky - VZOREK
sérum
Vyšetření retikulocytů - POSTUP
- Příprava směsi krve s barvivem:
- Do kepu s brilantkresylovou modří se nadávkuje 50 μ l fyziologického roztoku
- Dobře se promísí a poté se přidá 50 μ l promísené plné nesrážlivé EDTA-krve
- Vše se důkladně promíchá (netřepat!) - Inkubujeme za pokojové teploty 20 - 30minut
Zhotovení nátěrů pro odečet retikulocytů:
1. Po uplynutí 20–30 minut se provede nátěr
2. Na podložní sklíčko se nanese kapka směsi krve s barvivem ze zkumavky a roztěrovou lopatkou (podložním sklíčkem) se zhotoví tenký nátěr (,,do ztracena”)
3. Ponechá se volně oschnout na vzduchu (minimálně 10 minut)
4. Nátěr se hodnotí pod mikroskopem při 1000násobném zvětšení a to tak, že se pozoruje přibližně 10 zorných polí po 100 erytrocytech (tj. 1 000 erytrocytů)
5. Hodnotí se přítomnost zrn, klubek, event. Sítí
6. Výsledný počet retikulocytů se vyjadřuje jako početní zlomek na 1000 erytrocytů, tj. v procentech nebo v tisícinách.
RETIKULOCYTY MUSÍME PROSVĚTLOVAT MIKROSKOPEM, ABYCHOM SE UJISTILI, ŽE JDE OPRAVDU O RETIKULOCYT = PŘI PROSVĚTLOVÁNÍ JADÉRKA NESVÍTÍ
Vyšetření retikulocytů - HODNOTY
- Výsledek se uvádí v tísícinách všech erytrocytů
- NAJDU JICH 5 = 0,005
- Fyziologické hodnoty: 0,5 – 1,5 % nebo 0,005 - 0,015 (vyjádřeno v tisícinách)
Křížová zkoužka - PRINCIP
- Pomocí nepříméha antiglobulinovéha a enzymatického testu hledáme v séru příjemce protilátky namířené proti antigenům na erytrocytech dárce.
Křížová zkoužka - REAGENCIE
- AGH
- Bromelin
- Checkcells
Křížová zkoužka - VZOREK
- Vzorek PŘIJEMCE (SÉRUM)
- Vzorek DÁRCE (KRVINKY)
Křížová zkoužka - POSTUP
Příprava vzorků:
* K vyšetření potřebujeme sérum příjemce a krvinky dárce
* Krvinky dárce vytlačíme ze segmentu krevního vaku do předem řádně označené
* Zkumavky číslem krevní konzervy a přiřazeným číslem laboratorního vyšetření
* NÁSLEDUJE PROMYTÍ KRVINEK DÁRCE V NADBYTKU FR
- 3X, CENTRIFUGACE 3 MIN/3000 OT
* PO SLITÍ SUPERNATANTU DOŘEDÍME NA 5% NÁPLAV KRVINEK VE FR
Provedení:
1. Připravíme si zkumavky
- 1 vasermanovu na náplav
- 2 aglutinační zkumavky:
- První zkumavku označíme číslem konzervy a pořadovým číslem vyšetření a NAT
- Druhou zkumavku označíme číslem konzervy a pořadovým číslem vyšetření a ET
- Do první zkumavky (NAT) nakapeme 2 kapky séra příjemce a 1 kapku krvinek dárce
- Inkubujeme 1 hodinu při 37 stupních
- ODEČÍTÁME MAKROSKOPICKY
- Všechny ERY musí být v zorném poli rozptýleny jednotlivě
- Pokud se objeví drobné rulování přikápneme kapku FR a rulování musí zmizet
- Musíme odečíst I V MIKROSKOPU
- KDYŽ NENÍ PŘÍTOMNA AGLUTINACE = 3-5x promyjeme = přidáme 2 kapky AGH = hodnotíme MAKROSKOPICKY I MIKROSKOPICKY
NEGATIVNÍ VÝSLEDKY KONTROLUJEME POMOCÍ CHECHCELLS (1 KAPKA, 1MIN/2000ot = MUSÍ BÝT POZITIVNÍ)
- Do druhé zkumavky (ET) nakapeme 2 kapky séra příjemce, 2 kapky krvinek dárce a
1 kapku bromelinu
- Inkubujeme 15-20min při pokojové teplotě
- Centrifugujeme 1min/1000ot
- Odečítáme MIKROSKOPICKY I MAKROSKOPICKY
!!!!VÝSLEDKY MUSÍ BÝT NEGATIVNÍ!!!
Osmotická rezistence - PRINCIP
- V hypotonickém prostředí přijímají erytrocyty vodu z vnějšího prostředí
- Po dosažení kritického objemu dojde k porušení buněčné membrány a uvolnění hemoglobinu do vnějšího prostředí
Osmotická rezistence - REAGENCIE
- 1% roztok NaCl (fyziologický roztok)
- Destilovaná voda
Osmotická rezistence - VZOREK
- KREV pacienta
Osmotická rezistence - POSTUP
- Do zkumavek se napipetujem po 1 ml jednotlivých roztoků (dle tabulky)
- Jako pozitivní kontrola se použije destilovaná voda, jako negativní fyziologický roztok
- Do všech zkumavek se přidá po 1 kapce vyšetřované krve
- Zkumavky se přikryjí parafilmem, dobře se promíchají a inkubují při pokojové teplotě 15 minut
- Pak se centrifuguje 1000 ot. / 5 min a odečítá se výsledek
- VE ZKUMAVCE S FYZIOLOGICKÝM ROZTOKEM = nenastane hemolýza, krvinky tvoři souvislý sediment, ostře ohraničený od bezbarvého supernatanu
- VE ZKUMAVCE S DESTILOVANOU VODOU = nastala kompletní hemolýza, ve zkumavce není žádný sediment erytrocytu, tekutina ve zkumavce je červená
MINIMÁLNÍ OSMOTICKÁ REZISTENCE = Odečítáme počátek hemolýzy, VĚTŠÍ číslo, ta zkumavka, kde už nevidíme přímo sraženinu, ale ery už začínají hemolyzovat
MAXIMÁLNÍ OSMOTICKÁ REZISTENCE ta je udána tou koncentrací NaCl, v níž je červená barva roztoku shodná s červenou barvou zkumavky s destilovanou vodou, MENŠÍ číslo, je to ta zkumavka, kde už trochu na dně vidíme shluky
KDYŽ SI NEJSME JISTÝ = UJIŠŤUJEME SE V MIKROSKOPU
Osmotická rezistence - HODNOTY
MINIMÁLNÍ = 0,45 - 0,40%
MAXIMÁLNÍ = 0,35 - 0,30%
Příjemce - VYŠETŘENÍ
- Krevní skupina v AB0 systému
- Podskupina
- Rh faktor
- screening (enzymaticky a NAT)
- Když POZITIVNÍ =
- Identifikace protilátky
- Když POZITIVNÍ =
Duke - PRINCIP
- Orientační metoda ke zjištění krvácivosti prováděná in vivo (na člověku přímo).
- Testujeme funkci destiček, schopnost tvorby trombocytové zátky.
- Provádí se při podezření na poruchy hemostázy
Duke - POSTUP
- Pacient, který je vytemperovaný na teplotu místnosti, se posadí do vyšetřovacího křesla
- Drobný aseptický vpich do ušního lalůčku (ev. bříška 4. prstu) pacienta
- Měří se stopkami čas, za který přestane spontánní tvorba kapek krve (pořád otíráme/ťupkáme)
Duke - HODNOTY
2–5 minut
Duke - ZVÝŠENÝ
dysfibrinogenémii, trombocytopenii, funkční poruchu trombocytů, von Willebrarrdovu chorobu, hemofilii, DIC
Duke - SNÍŽENÝ
IM, některé hyperlipoproteinémie
Dárce - VYŠETŘENÍ
- krevní skupina
- pokud A nebo AB = podskupina A1 a A2
- Rh faktor
- Rh antigeny = c,C,e,E antigeny a Ká antigeny
Těhotná - VYŠETŘENÍ
- Krevní skupina v AB0 systému
= Když vejde skupina A či AB
- Podskupina A1, A2 - Rh faktor
- screening protilatek (enzymaticky a NAT)
=Když vyjde POZITIVNÍ
- Identifikace protilátek
- titr protilátek
Quick test (TT) a INR - PRINCIP
= Do dekalcifikované plazmy je přidán tkáňový tromboplastin a kalciové ionty
=Tímto způsobem se aktivuje vnější a poté společná cesta. Měří se čas do vzniku prvního vlákna fibrinové sraženiny.
Quick test (TT) a INR = MANUÁLNĚ - REAGENCIE
- Tromboplastin tkáňový=Tromboplastin DS
- kalciový ionty (CaCl2)
- Vzorek plazmy normální a pacientovy
Quick test (TT) a INR = MANUÁLNĚ - POSTUP
- Všechny reagencie vytemperujte na teplotu 37 o C
- Do zkumavky si dáme 0,1m1 vyšetřované plazmy a přidáme 0,l ml tkáňového tromboplastinu a 0,1 ml kalciových intů
- Ihned, když přidáme kalciové inty, spouštíme stopky a začínáme v lázni háčkovat.
- Háčkujeme až do vzniku koagula.
- Čas do vzniku koagula je Quickův čas
- Porovnáme s fyziologickými hodnotami.
Quick test (TT) a INR = PŘÍSTROJ - REAGENCIE
- INR komerční reagencie (Protime, která již kalcové inty obsahuje)
- Vzorek plazmy normální a patologické (kontroly)
- Vzorek pacienta
- Pipety, cupy (KEPY)
- Přístroj ECL 412
Quick test (TT) a INR = PŘÍSTROJ - POSTUP
- Zapneme přístroj a necháme vytemperovat na 37 o C (proběhne automaticky, doba je cca 20 minut v závislosti na teplotě v laboratoři, přístroj hlásí vytemperování)
- Všechny reagencie vytemperujeme v přístroji v příslušných pozicích pro temperování (černé pozice pro cupy a velké pozice pro reagencie a vzorky)
- Načteme kyvety z kódu na pytlíku
- Zapneme tlačítka ANALYSIS, SCREENING TEST, vybereme metodu PT, a rozbalí se nám, kolik a čeho pipetujeme:
- 50 μl vyšetřované plazmy (sample)
- 50 μl komerční reagencie Protime
- dáme OK
- Zmáčkneme pracovní pozici, zeptá se nás, zda chceme měřit vzorek (sample) nebo kontrolu, dáme měření vzorku, rozbalí se nám klávesnice pro označení čísla vzorku
- Označíme číslo vzorku např. 01, 02, …a enter
- Zobrazí se ADD tube – vložíme prázdný vytemperovaný cup, rozbliká se červený rámeček – ADD sample
- Napipetujeme vzorek – rozbliká se červený rámeček a začne běžet čas inkubace (120 sekund)
- Ozve se signalizace k napipetování reagecie ADD Protime - napipetujeme komerční reagencii
- Rozbliká se červený rámeček – přístroj zahájí měření (MESURE)
- Systém měří čas až do ukončení procesu srážení, měření je automaticky ukončeno, jakmile je detekována sraženina.
- Zobrazí se výsledek RESULT (v sekundách), výsledek se automaticky vytiskne a zapíše se do tabulky měření
- Vyhodnotíme výsledek, porovnáme s fyziologickým rozmezím
Quick test (TT) a INR - HODNOTY
12–15 s
INR: 0,8–1,2 (80–120 %) (ratio)
INR - VÝPOČET
(PT pacient / PT kontrola) isi (nadruhou)
INR - SNÍŽENÉ
Při zvýšené srážlivosti krve je INR nižší, při prodloužené srážlivosti (např. při léčbě antivitaminem K) se INR zvyšuje.
PT - ZVÝŠENÉ
- fyziologicky u novorozenců – nedostatek faktoru VII
- terapie Warfarinem nebo jiné stavy s hypovitaminózou K
- terapie heparinem i.v.
- těžká porucha jaterní proteosyntézy
- konsumpční koagulopatie – DIC
PT - SNÍŽENÉ
- Hyperkoagulační stavy
- Trombózy
APTT - PRINCIP
- Toto vyšetření se využívá k hodnocení VNITŘNÍ CESTY hemokoagulace
- Ve vzorku plazmy zahřáté na tělesnou teplotu po přidání komerční reagencie APTT a roztoku chloridu vápenatého dojde k rekalcifikaci vyšetřované plazmy a v přítomnosti reagenčního roztoku APTT ke vzniku fibrinového vlákna.
APTT = MANUÁLNÍ - REAGENCIE
- APTT komerční reagencie
- Roztok chloridu vápenatého CaCl2
- Vzorek plazmy normální a pacientovy
APTT = MANUÁLNÍ - POSTUP
- Všechny reagencie vytemperujte na teplotu 37C
- Do zkumavky si dáme 100ul (0,1 ml) vyšetřované plazmy (vzorku) a přidáme 100ul (0,1 ml) ml APTT reagentu a 100ul (0,1 ml) ml roztoku CaCl2
- Ihned, když přidáme roztok chloridu vápenatého, spouštíme stopky a začínáme v lázni háčkovat.
- Háčkujeme až do vzniku koagula (hlen ve zkumavce) = můžeme i na chvíli vyndat, abychom ho viděli lépe
- Čas do vzniku koagula je APTT čas
- Porovnáme s fyziologickými hodnotami
APTT = PŘÍSTROJ - REAGENCIE
- APTT komerční reagencie (Actime)
- Vzorek plazmy normální a patologické (kontroly), vzorek pacienta
- Roztok chloridu vápenatého CaCl2
- cupy
- Přístroj ECL 412
APTT = PŘÍSTROJ - POSTUP
- Zapneme přístroj a necháme vytemperovat na 37C (proběhne automaticky, doba je cca 20 minut v závislosti na teplotě v laboratoři, přístroj hlásí vytemperování)
- Všechny reagencie vytemperujeme v přístroji v příslušných pozicích pro temperování (černé pozice pro cupy a velké pozice pro reagencie a vzorky)
- Načteme kyvety z kódu na pytlíku
- Zapneme tlačítka ANALYSIS, SCREENING TEST, vybereme metodu APTT, a rozbalí se nám, kolik a čeho pipetujeme:
- 50 μl APTT reagentu (actime)
- 50 μl vyšetřované plazmy (sample)
- 50 μl roztoku chloridu vápenatého CaCl2
- dáme OK
- Zmáčkneme pracovní pozici, zeptá se nás, zda chceme měřit vzorek (sample) nebo kontrolu, dáme měření vzorku, rozbalí se nám klávesnice pro označení čísla vzorku
- Označíme číslo vzorku např. 01, 02, …a enter
- Zobrazí se ADD tube – vložíme prázdný natemperovaný cup, rozbliká se červený rámeček – ADD Actime
- Napipetujeme komerční reagencii, rozbliká se zelený rámeček ADD sample
- Napipetujeme vzorek – rozbliká se červený rámeček a začne běžet čas inkubace (170 sekund), připravíme se k napipetování startéru (CaCl2)
- Ozve se signalizace k napipetování startéru (CaCL2), máme na to jen 20 sekund, jinak je měření neplatné!!!
- Napipetujeme startér a rozbliká se červený rámeček - přístroj zahájí měření
(MESURE). Systém měří čas až do ukončení procesu srážení, měření je automaticky ukončeno, jakmile je detekována sraženina. - Zobrazí se výsledek RESULT (v sekundách), výsledek se automaticky vytiskne a zapíše se do tabulky měření
- Vyhodnotíme výsledek, porovnáme s fyziologickým rozmezím
APTT - HODNOTY
- 36-40 s
- APTT ratio: 0,9–1,1 (80–110 %) (ratio)
- Hodnota APTT-Ratio nad 3 je kritická! (odpovídá času pacienta kolem 90 sekund)
APTT - ZVÝŠENÉ
vrozené defekty koagulačních faktorů, užívání antikoagulanciií – léčba heparinem
APTT - SNÍŽENÉ
hyperkoagulační stavy, trombotické komplikace
Novorozence - VYŠETŘENÍ
- Krevní skupina v AB0 systému
- Podskupina A1, A2
- Rh faktor
- Coombs přímý
Coombs přímý - PRINCIP
- Senzibilizované erytrocyty (erytrocyty s navázanou protilátkou) jsou aglutinovány antiglobulínovým sérem
- Tento test slouží k průkazu aloprotilátek a autoprotilátek navázaných na vyšetřované erytrocyty in vivo = v krevním oběhu (novorozenci, susp. AIHA)
Coombs přímý - REAGENCIE
- DIAGNOSTICKÉ SÉRUM AGH
- SENZIBILIZOVANÉ KRVINKY CHECKCELLS
Coombs přímý - VZOREK
- KREV pacienta (NÁPLAV)
Coombs přímý - POSTUP
1) Označíme si:
- aglutinační zkumavku (1)
2) dáme suchou kapku do zkumavky a 3x promyjeme v nadbytku fyz.roztoku (3000ot/3min)
3) Přidáme 2 kapky AGH
4) Zkumavku promícháme
5) Cetrifugujeme 2500ot/20s
6) Odečítáme výsledek MAKROSKOPICKY jemným poklepem na dno zkumavky
- Správnost kontrolujeme přidáním 1 kapky Chechcells
- promícháme a centrifugujeme 2000ot/1min = MUSÍ BÝT POZITIVNÍ, když není:
= Špatně provedený test
= Špatná funkce AGH - Vyšetření se opakuje!!!
1000ot/1min
- aglutiníny
- titr
- křížová zkouška
- podskupiny
- Rh faktor
- screening
- identifikace
2500ot/20s
- aglutinogeny
- přímý coombs
- c,C,e,E antigeny
- Dweek
2000ot/1min
- checkcells
1000ot/5min
- osmotická rezistence
3000ot/3min
- náplav
- promývání
- hematokrit
NAT
-> 2 kapky séra pacienta, 1 kapka krvinek
-> pak 2 kapky AGH
kontrola: 1 kapka checkcells
inkubace: 37C 1hodinu (u Dw inkubace jen 15min)
po inkubaci (pokud není aglutinace) —> promýváme
⁃ Dweek, screening
ET
-> 2 kapky séra, 2 kapky krvinek, 1 kapka bromelinu
Inkubace: 15-20min pokojová teplota
⁃ screening, identifikace, titr
