KULTIVACE

Question 1

Kultivace bakterií (k čemu je, cíl)

Answer 1

= schopnost bakterií růst a množit se v neživých podmínkách, tedy v laboratoři

Cílem kultivace:
- získat čisté kultury bakterie, určit u nich rod, druh, stanovit citlivost na antibiotika
- Mikrobiolog musí vědět, kde se jaká bakterie vyskytuje běžně a kde být nesmí, tedy kde určitá bakterie může způsobit onemocnění

Question 2

Podmínky kultivace

Answer 2

a. Dostatek živin = aminokyseliny, cukry
b. Teplota:
- bakterie psychrofilní: mají rádi chladno 4C (pseudomonas)
- bakterie mezofilní: 4-42C (často 37C)
- bakterie termofilní: mají rádi teplo 42C (campylobacter)
c. pH = 7,4
d. Délka kultivace
- 24 hodin
- 48 hodin kapavka či meningokok
- 3 dny anaeroby
- 6. týdnů TBC
e. Vlhkost
f. Atmosféra
- anaerobní = nesnáší kyslík
- aerobní = potřebují kyslík
- fakultativně anaerobní = rostou i s kyslíkem i bez něho
- mikroaerofilní = mají rádi 5% kyslíku, zbytek CO2
(zvon (skleněná nádoba se skleněným víkem), dovnitř svíčku až vyhoří, je zde prostředí, který potřebujou - mikroaerofilní)

Question 3

Tekuté materiály a tkáně (co s nim děláme)

Answer 3

• přímý mikroskopický preparát
• kultivace na pevných půdách
• tekutá půda pro pomnožení bakterií

Question 4

Stěry a výtěry (co s nim děláme)

Answer 4

• kultivace na pevných půdách
• tekutá půda pro pomnožení bakterií

Question 5

Tekuté půdy (co to je a k čemu)

Answer 5

• bujon ve zkumavce
• Slouží jako pomnožovaní
  = pomnožení bakterií se pozná podle
  -> v tekuté půdě se udělá: zákal, blanka, sraženina
• Tekuté půdy slouží k pomnožení bakterií ve zkumavkách
• Jedná se o masopeptonový bujon  vývar z masa + pepton (bílkovina)

Question 6

Pevné půdy (základní rozdělení, co to je)

Answer 6

1. Transportní
   - Slouží k transportu bakterií pro stěry a výtěry (pevná černá půda v plastové zkumavce s výtěrovou tyčinkou)
2. Kultivační
   - v Petriho miskách
   - masopeptonový agar = je to vývar z masa + agarová řasa (bílkovina) + obohacovadla (aminokyseliny, cukry, vitaminy, ionty, krev)
   - Na pevné kultivační půdě probíhá vlastní kultivace
   - Po příjmu biologického materiálu se naočkuje na půdu biol. materiál, rozetře se a poté se dá na kultivovat: většinou na 37 stupňů, 24 hodin, fakultativně anaerobně

Hodnotíme:
Kolonie = jedna kolonie je shluk milionu bakterií

Hodnotíme: barvu kolonií, konzistenci, tvar, velikost, okraje, povrch, vůně, zápach, plazení 

Question 7

dělení dle účelu

Answer 7

1. základní - základ je různý druh bujónů zpevněný agarem, živný agar
2. obohacené - k základní půdě jsme něco přidali - například. krev (KA - krevní agar), sérum, vejce
3. selektivní - podporují růst jedněch bakterií a brzdí růst jiných, například. NaCl (8% NaCl KA), karmali
4. diagnostické - obsahují indikátory, například. barviva, která specifickým způsobem reagují na růst bakterií, díky nimž vidíme biochemické vlastnosti mikrobů
5. selektivní-diagnostické - kombinace potlačení růstu nežádoucích mikrobů a biochemických indikátorů, které využívají bakterie a díky nim ji známe - Např. ENDO, DC
6. jiné - například. na antibiotické zkoušky, uchovávání kultur, transportní půdy

Question 8

obohacené půdy

Answer 8

• Krevní agar (KA) = částěčně i diagnostická pokud přidáme NaCl
• Čokoládový agar (ČA) = přefiltrovaný se nazývá Levinthalův agar
• Šulova půda
• Schaedlerova půda
• Lövensteinova - Jensenova půda
• Sabouradova pôda
• C.C agar (GO + ATB agar)
• MK půda (GO)
• Karmali

Question 9

Chromogenní půdy

Answer 9

• jsou to diagnostické půdy
• obsahují indikátor, který když bakterie využije, její kolonie změní barvu
• bakterie jsou zde typicky zbarvené, například. MRSA půda (MSSA roste pouze v narůžovělém nádechu, MRSA tvoří normálně rostoucí světle růžové kolonie), STAG (STreptococcus AGalactiae roste v růžových koloniích, např. enterokok v modrých)
• používáme více vzorků na jednu půdu a vytváříme tzv. výseče - tyto půdy jsou mnohonásobně dražší než ostatní a musíme s nimi zacházet ekonomicky

Question 10

selektivní-diagnostické půdy

Answer 10

• ENDO
• DC (deoxy-cholát)
• CIN agar
• Clauberg (škovránek)

Question 11

tekuté půdy

Answer 11

• VL bujon
• Živný bujon
• BHI bujon (Brain-Heart-Infusion)
• Selenit
• Glukózový bujon
• Fyziologický roztok
• MH bujon

Question 12

Další speciální půdy

Answer 12

• Müller-Hinton agar (MH)
• Amies
• McConkey agar - obdoba Enda

Question 13

Krevní agar (KA)

Answer 13

• obohacená půda, částečně diagnostická
• nejběžnější půda v mikračce, přidává se ovčí krev k živnému agarovému základu ochlazenému na 45-50 °C, roste na něm naprostá většina lékařsky důležitých MO, umožňuje nám sledovat hemolytické vlastnosti vypěstovaných kmenů a díky nim je často diagnostikovat (beta-hemolytické strepto viridující streptokoky)
• na KA nám narostou G- tyčky, Pseudomonas, G+ koky (všech typů), G+ tyčky, kvasinky, G- koky
• s přídavkem 5% nebo 8% NaCl se jedná o selektivní půdy, které potlačují plíživý růst Protea
• Na 5% NaCl KA nám vyrostou enterokoky, streptokoky a stafylokoky
• Na 8% NaCl KA pouze stafylokoky

Question 14

Čokoládový agar (ČA)

Answer 14

• obohacená půda
• používáme jej na náročné bakterie, které nedokážou využít živiny z KA (nedokáží rozbít erytrocyty)
• vyrábí se přidáním erytrocytů do horkého základu (80 °C)
• využití na meningokoka, můžeme použít i na haemofila (ale ten vyroste i na KA s čarou STAU)
• přefiltrujeme-li jej přes filtr, získáme čirý Levinthalův agar

Question 15

Šulova půda

Answer 15

• obohacená půda
• přidáno bovinní sérum, kultivace mykobakterií

Question 16

Schaedlerova půda

Answer 16

• půda pro anaerobní kultivaci

Question 17

Lövensteinova - Jensenova půda

Answer 17

• obohacená půda
• přidává se vejce a malachitová zeleň
• plní se na šikmo do zkumavek
• na mykobakterie - TBC (Bacil Kochůvl - BK)
• obrázek: typické zbarvení L.-J. půdy s narostlými koloniemi

Question 18

Sabouradova pôda

Answer 18

• obohacená půda
• je tam přídavek cukrů
• kultivujeme zde plísně a kvasinky
• kvasinky na této půdě mají bílé zbarvení a typickou vůni po droždí
• častokrát pozorujeme morfologické odlišnosti kvasinek - bývají druhově specifické (je-li na plotně hladká kolonie a zvrásněná kolonie, může se jednat o dva rozdílné druhy kvasinek)

Question 19

C.C agar (GO + ATB agar)

Answer 19

• selektivní půda
• tmavě hnědočervená barva půdy
• obsahují antibiotika, která potlačují růst jiných bakterií
• půda se používá k záchytu Neisseria gonorrhoeae, ta tam roste v maličkých koloniích, což je pro ni typické (je-li NEGO ve vzorku hojná, vyroste i na KA)

Question 20

MK půda (GO)

Answer 20

• obohacená půda
• je to půda, která je velmi výživná, narostou nám na ní choulostivé mikroorganismy
• na plotně je napsáno GO, my ji voláme MK
• dáváme ji zatavit do speciální atmosféry (vložíme do pytlíku do speciální směsi plynů - poměr dusíku a CO2) a v tomto nám často vyrostou i některé druhy anaerobních bakterií
• používáme ji u důležitých materiálů, jako jsou hemokultury (poté, jak přístroj signalizuje pozitivitu a my krev z lahvičky vyočkujeme na půdy), stěry z TEP (Trvalá EndroProtéza, např. umělá kyčel),…
• pokud nám aerobně nic nevyroste, často bakterie vyroste právě na MKáčku
• rostou tam G- tyčky, G+ koky, G+ tyčky,…

Question 21

Karmali

Answer 21

• selektivní půda
• obsahuje aktivní černé uhlí, ATB, které inhibují jiné bakterie
• používáme na bakterii Campylobacter (inkubujeme 48 hod./42°C/speciální atmosféra)
• vyrostou tam však i jiné bakterie, čili při hodnocení pozitivity je třeba být opatrný a použít další testy (oxidázový papírek - Campylobacter ho má pozitivní = modrý, MALDI-TOF, mikroskopický preparát)

Question 22

ENDO

Answer 22

• selektivní-diagnostická půda
• růžová barva půdy
• rostou zde G- tyčky - enterobakterie, pseudomonády
• selektivita - rostou pouze G- tyčky, max. kvasinky, ostatní jsou inhibovány bázickým fuchsinem, a diagnostická - obsahuje laktózu - bakterie, které ji štěpí, na ní rostou tmavě růžovo až kovově a které ji neštěpí světlo až průsvitně - důležité bakterie salmonelly nebo shigelly
• důležitá půda na všech stanicích na mikročce - stolice, moče, difterka i klinická - používáme ji úplně všude

Question 23

DC (deoxy-cholát)

Answer 23

• selektivní-diagnostická půda
• rostou zde G- tyčky
• je to půda, která látkami ve svém obsahu potlačuje plíživý růst Protea (Proteus na Endě a KA roste plazivo, vytváří vlny, je schopen porůst za krátkou dobu celou plotnu a tím kontaminovat jiné důležité bakt. kolonie, proto pokud je chceme dostat odtamtud, používáme tuto půdu)
• bakterie, které tvoří H2S rostou v koloniích s černým středem – například Salmonella (na obrázku), Proteus – základní půda na stolicích - černé a světlé bakterie nás zde zajímají
• Např. takový Citrobacter roste jako kolonie s černým středem a růžovým okrajem (na rozdíl od Salmonelly, která má okraj světlý)

Question 24

CIN agar

Answer 24

• selektivní-diagnostická půda
• rostou nám zde yersinie (typické kolonie na obrázku)
• k tomu, abychom vyšetřovali Yersinie potřebujeme mít speciální požadavek na žádance - běžně se nevyšetřuje (ve vzácných případech vyroste i na Endě)
• lékař si musí toto vyšetření vyžádat, protože má prodlouženou kultivaci a odlišné zpracování, na rozdíl od běžného zpracování výtěrů ze stolice
• používáme ji na stolicích

Question 25

Clauberg (škovránek)

Answer 25

• selektivní-diagnostická půda
• pro Corynebacterium diphtheriae
• použití na difterické laborce a na klinické na stěrech z DÚ nebo výtěrech z hnisu z ucha - všude tam, kde by se mohla uplatňovat Corynebacterium diphtheriae

Question 26

VL bujon

Answer 26

• anaerobní kultivace
• obsahuje trypticky natrávenou svalovinu, kvasnicový extrakt, cystein a glukózu
• pokud nám přijde vzorek na anaerobní kultivaci, štětičku opatrně otíráme o zeď zkumavky, aby se uvolnily bakterie a zároveň aby se do bujónu dostalo co nejméně vzduchových bublinek
• kultivujeme v anaerostatu/anaeroboxu

Question 27

Živný bujon

Answer 27

• základní bujon v mikračce
• používáme k pomnožování vzorků - stolice - přítomnost S. aureus, difterka - uši a klinická - vše kromě screeningu na S. agalactiae
• jeho zakalení znamená přítomnost a množení bakterií

Question 28

BHI bujon (Brain-Heart-Infusion)

Answer 28

• vysoce výživný bujon, používáme k pomnožování likvoru

Question 29

Selenit

Answer 29

• selektivní-pomnožovací bujon
• v tomto bujónu by se měla obzvlášť dobře pomnožit Salmonella a pomnožování jiných bakterií by mělo být potlačeno, ale například. E. coli se tam běžně namnoží
• použití k pomnožování výtěrů ze stolice

Question 30

Glukózový bujon

Answer 30

• použití k pomnožování stěrů z prostředí
• často nám chodí stěry například. z transfúzní služby, kde se kontroluje sterilita prostředí

Question 31

Fyziologický roztok

Answer 31

• do fýzáku “nakládáme” věci - pokud se bude dělat z bakt. kolonie ATB citlivost, musíme tuto kolonii nejprve rozmíchat ve fýzáku, kdy dostaneme homogenní suspenzi a nárůst na MH agaru bude rovnoměrný
• tuto hustotu měříme denzitometrem pomocí McFarlandovy stupnice
• není to klasický bujon, ale je zde zařazen, protože ho v laborce často používáme

Question 32

MH bujon

Answer 32

• do MH bujonu nakládáme bakterie, ze kterých se bude dělat MIC
• v tomto bujónu se bakterie pomnožují několik hodin (2 hodiny G-bakterie a 4 hodiny G+ bakterie) a následně se z nich dělá MIC

Question 33

Müller-Hinton agar (MH)

Answer 33

• na antibiotické citlivosti, neobsahuje pepton (bránil by difúzi ATB) ale obsahuje škrob (ten chrání před toxickými metabolity a zároveň umožňuje růst z malého inokula) - žlutá plotna
• pro náročnější bakterie (např. beta hemolytické nebo alfa hemolytické streptokoky)
• používame MH-F = MH s přidáním koňské krve - červená plotna

Question 34

Amies

Answer 34

• je to transportní půda, která udržuje bakterie v životaschopném stavu během transportu, chrání před vnějšími vlivy (např. kyslíkem), omezují metabolismus a absorbují toxické produkty (přídavek aktivního uhlí)
• nemá význam dávat vzorek výtěru stolice přinesené bez transp. média na karmalu na vyšetření Campylobactera, protože by tu cestu nepřežil

Question 35

Očkování půd

Answer 35

1. tuhá -> tuhá (např. izolace)
   1 -> nabereme si z tuhé půdy kličkou bakterie -> rozočkujem na novou tuhou půdu
2. očkování ATB -> používáme 2ml fyz.roztoku (ATB rezistence)
   2 -> z tuhé půdy si nabereme kličkou bakterie -> rozmícháme je ve fyz.roztoku -> tyčinkou potřeme správně MH půdu -> narazítkujeme ATB
3. tuhá -> tekutá (pomnožení bakterií, oživení kultury)
   3 -> z tuhé půdy si nabereme bakterie kličkou -> opálíme okraj zkumavky s tekutou půdou -> nakloníme zkumavku s tekutou půdou a kličkou na které máme bakterie potřeme vrchní stranu zkumavky nad tekutinou -> znovu opálíme okraj zkumavky
4. tekutá -> tuhá (např. izolace po pomnožení)
   4 -> opálíme okraj zkumavky s tekutou půdou, kde máme bakerie -> nabereme si bakterie z tekuté půdy do kličky -> znovu opálíme okraj zkumavky s tekutou půdou -> rozočkujeme bakterie na tuhé půdě
5. šikmá půda -> méně vysychá, větší plocha (např. na TBC)
   5 -> nabereme si tyčinkou bakterie -> hadovitě potřeme plochu šikmé půdy
6. tekutá -> tekutá (zjišťování koncentrace)