Séquencage de nouvelle génération Flashcards
Vrai ou faux
Tous les organismes peuvent être séquencer pour le séquencage de nouvelle génération
Vrai
Quelles sont les étapes pour le séquencage par 454/ion torrent?
- Synthèse de banque
- Amplification sur support solide
- Séquencage
Quelle étape du séquencage est absence pour Illumina comparativement au 454?
Quelle étape est différente?
séquencage
- Génération ilots
Quelle est l’étape critique de la synthèse de banque?
Rendre les molécules compatibles avec le séquenceur
Vrai ou faux
Chaque séquenceur a ses propres séquences
Vrai
Comment fonctionne la synthèse de banque WGS- shotgun?
Fragmentation aléatoire
Fragment end repair -> polymérase et exonucléase
A tailing -> Taq pol
Ligation des adaptateurs
Pour la méthode shotgun, quelles sont les amorces pour faire la PCR?
Pour quoi est utile la PCR?
adaptateur
Pour la sélection de taille
-> avoir seulement les bons fragments
Pour quelles approches est bien adapté la synthèse de banque shotgun?
approches comparatives avec génome de référence
Quelle méthode est bien adapté pour les approches de novo de génomes peu complexes et ADNc
shotgun
Quel problème peut être rencontrer avec la synthèse de banque shotgun?
Bris de contigs quand il y a des éléments répétés
Quelles sont les principales caractéristiques de la synthèse de banque par approche ciblée amplicon?
- Cible une ou quelques régions spécifiques
- Requiert les méthodes les plus standardisées
- La plus facilement multiplexable
Le génotypage pas séquencage est une approche…
semi-aléatoire
Pour le génotypage par séquencage, de quoi dépend la densité en marqueur?
de la sélection d’enzymes
À quoi servent les synthèse de banque capture?
Sonde utilisée pour pêcher les molécules d’intérêts
Qu’est ce que l’amplification sur support solide?
Les différentes molécules sont ancrées sur un support solide
Amplification des molécule
-> Permet d’amplifier le signal de séquencage
Décrire la méthode d’amplification sur support solide
À quoi faut-il faire attention?
- Mélange ADN dénaturé avec billes, mix PCR et huile
- > Attention au ratio ADN/bille
- Ampification dans microréacteurs 4 plaques PCR de 96 puits
- Purification et enrichissement des billes qui contiennent de l’ADN amplifié
Décrire le séquencage par 454/ion torrent
- Polymérase ajoute un nucléotide, ce qui relâche un pyrophosphate et un proton
- > Ion torrent détecte le proton par un changement de pH
- > 454 converti le PPi à l’aide de la sulfurylase pour générer de l’ATP qui est utilisé par la luciférase pour produire de la lumière
Décrire la réaction séquence Illumina
- Incorporation d’un nucléotide fluorescent
- l’incorporation d’un nucléotide bloque l’élongation
- Le blocage est réversible pour permettre l’ajout des nucléotide 1 à la fois
Décrire le séquencage PacBio
- Une molécule est immobilisée par puit par un polymérase
- Les 4 nucléotides marquée avec un fluorophore passent dans le puit
- Quand un nucléotide est incorporé, on mesure le signal
Décrire le séquencage Oxford nanopore
- Molécules d’ADN sont capter par un pore
- Un brin passe au travers du pore et une différence de potentiel est mesurée
- Chaque nucléotide à sa signature
Quelles sont les points faibles des approches de séquencages de troisième génération?
- Plus cher
- Taux d’erreur plus élevé
Qu’est ce qui remplace les Mate-pairs pour l’assemblage des génomes?
Avantage?
les long reads
Plus facile d’identifier les variants structuraux
Quelle approche permet d’acquérir peu d’informations sur beaucoup de molécules?
GBS
Quelle approche permet d’acquérir beaucoup d’informations sur peu de molécules?
Amplicon
Quelles sont les paramètres importants considérer?
- Lecture simple ou en paire en relation avec la taille de l’insert
- La longueur des lectures vs le nombre de lecture
- La longueur des lectures et l’assemblage
- La diversité de la librairie vs le nombre de lecture
- Taux et type d’erreur
- $$$
Mettre en ordre du - au + bon les instruements pour les erreurs d’homopolymère
3e génération > Ion torrent > illumina
Mettre en ordre du - au + bon les instruments pour les erreurs de substitutions
3e génération > Illumina > ion torrent
Quelles contraintes budgétaires doivent être considérer?
- Nombre d’échantillons
- Type de librairie
- Type de séquencage
depuis dix ans ces prix ont augmenter ou diminuer?
a) librairie shotgun
b) séquencage ion torrent
c) séquencage illumina (gros instruments)
d) séquencage illumina (petit instruments)
a) -
b) pareil
c) bcp -
d) un peu plus
Quelles sont les applications les plus courantes du séquencage de nouvelle génération?
Pour :
- Génomique comparative
- Métagénomique
- Transcriptomique
définir génomique comparative
Étude des structures / fonctions des génomes
Quelles sont les deux approches pour la génomique comparative?
1) Contenu en gène (shotgun)
- > Séquencage au moindre cout possible, assemblage de base, comparaison de ORFs et SNPs
2) Structure des génomes
- > Permettre de fermer les génomes, différences structurelles en plus des différences de contenu
Quels sont les facteurs à considérer pour la génomique comparative?
- Taille du génome
- Référence existante ou pas
- Budget
Quelle approche est utilisée pour les études de diversité?
Amplicon
Quels facteurs sont à considérer lors de l’étude de diversité pour le choix de séquenceur?
- Longueur désiré
- Diversité (bcp de lecture)
Qu’est ce que la transcriptomique?
Étude de l’ensemble des transcrits d’un organisme
Quelle étape est nécessaire avant le shotgun pour la transcriptomique?
RT
À quoi sont égal les «reads» en transcriptomique?
Au niveau d’expression
Quel séquenceur pour la transcriptomique?
- Haut volume
Contenu en gène + population =…
métagénome
Comment fait-on de la métagénomique?
- Synthèse de banque shotgun
- Comparaison de contigs et lectures suffisante
- identification des polymorphismes
- Comptes relatifs importants
Quelle méthode est utilisée pour la délimitation des espèces?
GbS
