Ch.5 Les banques d'ADN

Question 1

Que faut-il pour cloner un gène d’un organisme donné?

Answer 1

faut disposer d’une banque de clones provenant de cet organisme

Question 2

Qu’est ce qu’une banque d’ADN

Answer 2

une collection de clones recombinants

Question 3

Que permet la banque d’ADN?

Answer 3

permet d’isoler et d’analyser des gènes individuels, d’étuider l’organisation des gènes et d’élucider la séquence complète d’un génome

Question 4

Décrire les caractéristiques des banques d’ADN génomiques

Answer 4

• Sont composées de clones d’ADN recombinant dont
l’ensemble représente tout le matériel génétique de
l’organisme étudié
• Peuvent être construites à partir de n’importe lequel
des tissus d’un organisme multicellulaire
• Contiennent tous les éléments de séquence du
génome : gènes exprimés et non exprimés, exons et
introns, régions promotrices et de terminaison,
séquences intergéniques

Question 5

Décrire les caractéristiques des banques d’ADNc

Answer 5

• Sont composées de clones d’ADN recombinant dont
l’ensemble représente la population d’ARNm d’un
tissu donné de l’organisme étudié. Des banques
construites à partir de différents tissus d’un même
organisme peuvent donc être radicalement
différentes au niveau de leur composition si les
gènes exprimés dans ces tissus diffèrent
• Ne contiennent que les séquences codantes des
gènes exprimés (sans introns), de même que les
régions 5’-UTR et 3’UTR des ARNm
• Reflètent l’abondance des ARNm dans le tissu étudié

Question 6

De quoi dépend le nombre de clones requis pour construire une banque d’ADN génomique?

Answer 6

Dépend du vecteur de clonage utilisé et de la complexité du génome

Question 7

Que permet l’équation de Clarke et Carbon?

Answer 7

Estimer le nombre de clones à analyser pour trouver une séquence donnée dans une banque génomique

Question 8

Vrai ou faux

La méthode de fragmentation de l’ADN est peu importante pour la qualité de la banque d’ADN génomique

Answer 8

Faux, Joue un rôle important

Question 9

Idéalement l’ADN génomique doit être fragmenté ____ dans le but de produire des fragments…

Answer 9

au hasard, qui se recoupent et qui sont d’une longueur appropriée pour le vecteur de clonage

Question 10

Comment obtient-on habituellement les fragments d’ADN génomique?

Answer 10

par digestion partielle de l’ADN génomique avec des enzymes de restriction coupant fréquemment

Question 11

Quelles sont les différentes étapes d’un protocole de digestion partielle d’ADN génomique?

Answer 11

1. Détermination des conditions de digestion sur une échelle
   analytique
   a) On digère une quantité constante d’ADN avec des quantités
   variables d’enzyme pendant une période donnée, ou on incube
   l’ADN avec une quantité constante d’enzyme pendant des périodes
   variables
   b) La progression des digestions est suivie par électrophorèse sur gel
2. Digestion partielle d’une grande quantité d’ADN en utilisant les
   conditions déterminées précédemment
3. Fractionnement des fragments de longueurs désirées par
   électrophorèse sur gel d’agarose ou centrifugation sur gradient
   de sucrose

Question 12

Que permettent les banques d’ADN génomique construites à partir d’ADN fragmenté de manière aléatoire?

Answer 12

La marche le long d’un chromosome

Question 13

Pour quoi est utilisée la marche chromosomique?

Answer 13

Pour cloner des gènes liés à des marqueurs polymorphiques
Aussi utilisée pour obtenir la séquence complète d’un gène pour lequel on ne possède qu’un clone de séquence partielle ou un clone d’ADNc

Question 14

À quoi est directement proportionnelle la longueur des pas effectuées lors de la marche chromosomique?

Answer 14

à la longueur des fragments insérés dans le vecteur

Question 15

Le fragments utilisé comme sonde ne doit contenir aucune _______ car la marche serait…

Answer 15

séquences répétées, interrompue

Question 16

Lorsque des promoteurs pour des ARN polymérases de phages sont situés de part et d’autres des insertions…

Answer 16

des sondes d’ARN spécifique aux extrémités peuvent être produites

Question 17

Une banque d’ADN génomique peut être construite avec quels vecteurs?

Answer 17

vecteur lambda de remplacement, un cosmide ou un vecteur PAc, BAC ou YAC

Question 18

Pourquoi le vecteur lambda de remplacement est préféré pour la construction de banques d’ADN génomique?

Answer 18

• plus facile à construire et maintenir une banque génomique dans un phage lambda que dans un cosmide
• Criblage de banques génomiques est plus facile à effectuer par hybridation de plages de lyse que par hybridaton de colonies.

Question 19

Dans quel cas les cosmides sont privilégiés pour la construction de banques d’ADN génomique?

Answer 19

Lorsque le gène désiré ne peut être contenu dans un seul phage lambda recombinant

Question 20

Pour quoi sont utiles les vecteurs PAC, BAC et YAC dans la contruction de banques d’ADN génomiques?

Answer 20

Pour isoler de très longs segments de chromosome

-construire une série de clones couvrant une grande région d’un génome

Question 21

Le criblage d’une banque d’ADNc exprimée à l’aide d’un anticorps spécifique à une protéine nécessite ____ plus de clones
Pourquoi?

Answer 21

3-6 fois

Les anticorps ne réagissent qu’avec une sous-classe des clones portant la séquence d’ADNc désiré. Ce sont les clones dans lesquels l’ADNc a été inséré dans le bon cadre de lecture et la bonne orientation

Question 22

Dans quel contexte les séquences d’ADNc peuvent être exprimées chez E. coli?

Answer 22

Si elles sont clonées en phase avec une gène de fusion porté par le vecteur de clonage

Question 23

Seulement ____ des clones d’ADNc inséré dans un site de restriction unique du gène de fusion auront la bonne polarité

Answer 23

la moitié

Question 24

Dans quel cas la totalité des clones d’ADNc auront la bonne polarité?

Answer 24

dans le cas d’un clonage directionnel dans le gène de fusion

Question 25

Vrai ou faux

Les vecteurs PAC, BAC et YAC d’insertion sont les vecteurs les plus utilisés pour le clonage d’ADNc

Answer 25

Faux, les vecteurs lambda d’insertion

Question 26

Avant 1983, le clonage d’ADNc se faisait presque
exclusivement dans des _______. Une banque
contenant 1-3 x 10^5 plasmides recombinants était
habituellement produite à partir de _____ d’ADNc

Answer 26

Avant 1983, le clonage d’ADNc se faisait presque
exclusivement dans des vecteurs plasmidiques. Une banque
contenant 1-3 x 105 plasmides recombinants était
habituellement produite à partir de 0.5 à 1.0 µg d’ADNc

Question 27

synthétiser l’ADNc et la disponibilité grandissante de linkers,
d’adaptateurs, de méthylases et de mélanges d’encapsidation, il
est devenu possible de tirer profit de la grande efficacité des
systèmes d’encapsidation in vitro de l’ADN de λ. Une banque de
106-107 phages recombinants indépendants est habituellement
obtenue à partir de _____ d’ADNc

Answer 27

100 ng

Question 28

Décrire les caractéristiques/ l’utilité des vecteurs suivant :
λg 10.

λgt11.

λgt22 et 23.

λZAP.

Answer 28

λg 10. Pour le criblage avec des sondes d’acides nucléiques (sélection hfl-)
λgt11. Pour construire des banques qui seront criblées à l’aide d’anticorps.
Le site unique de clonage EcoRI est situé 53 pb en 3’ du codon de
terminaison de lacZ; les ADNc ont une chance sur six d’être exprimés sous
forme de protéines de fusion avec la β-galactosidase. Le promoteur du gène
lacZ est inductible avec de l’IPTG et régulé de manière négative par le
répresseur lac (codé par le gène lacI)
λgt22 et 23. Vecteurs dérivés de λgt11 possédant un site multiple de
clonage. L’ADNc peut être cloné directionnellement dans les sites SalI et
NotI sans qu’il soit nécessaire de le protéger avec des méthylases, puisque
ces sites sont extrêmement rares dans les ADNc d’eucaryotes
λZAP. Ce vecteur est le prototype d’une nouvelle génération de vecteurs. Un
site multiple de clonage comprenant six sites uniques est situé dans le gène
lacZ’ de pBluescript. L’ADNc peut être sous-cloné in vivo dans pBluescript et
des sondes d’ARN complémentaires à l’ADNc peuvent être synthétisées
grâce aux promoteurs de phages T3 et T7

Question 29

Vrai ou faux

Les protéines de fusion sont produites de manière constitutive à partir de vecteurs lambda d’expression

Answer 29

Faux, ne sont pas

Question 30

La production de quelles molécules doivent être empêcher durant l’amplification de protéines de fusion?

Answer 30

la production de protéines potentiellement toxiques formées par les phages recombinant

Question 31

Vrai ou faux
Souvent, il n’est pas nécessaire de produire des banques d’ADNc cloné; on peut simplement analyser les produits PCR formés à partir de l’ARNm

Answer 31

vrai

Question 32

Vrai ou faux
Deux banques d’ADNc construites par PCR
peuvent être soustraites pour isoler les gènes
spécifiques à une de ces banques

Answer 32

vrai

Question 33

Vrai ou faux

Le complexe formé entre la biotine et l’avidine est peu stable

Answer 33

Faux, extrêmement stable