Ch.5 Les banques d'ADN Flashcards
Que faut-il pour cloner un gène d’un organisme donné?
faut disposer d’une banque de clones provenant de cet organisme
Qu’est ce qu’une banque d’ADN
une collection de clones recombinants
Que permet la banque d’ADN?
permet d’isoler et d’analyser des gènes individuels, d’étuider l’organisation des gènes et d’élucider la séquence complète d’un génome
Décrire les caractéristiques des banques d’ADN génomiques
• Sont composées de clones d’ADN recombinant dont
l’ensemble représente tout le matériel génétique de
l’organisme étudié
• Peuvent être construites à partir de n’importe lequel
des tissus d’un organisme multicellulaire
• Contiennent tous les éléments de séquence du
génome : gènes exprimés et non exprimés, exons et
introns, régions promotrices et de terminaison,
séquences intergéniques
Décrire les caractéristiques des banques d’ADNc
• Sont composées de clones d’ADN recombinant dont
l’ensemble représente la population d’ARNm d’un
tissu donné de l’organisme étudié. Des banques
construites à partir de différents tissus d’un même
organisme peuvent donc être radicalement
différentes au niveau de leur composition si les
gènes exprimés dans ces tissus diffèrent
• Ne contiennent que les séquences codantes des
gènes exprimés (sans introns), de même que les
régions 5’-UTR et 3’UTR des ARNm
• Reflètent l’abondance des ARNm dans le tissu étudié
De quoi dépend le nombre de clones requis pour construire une banque d’ADN génomique?
Dépend du vecteur de clonage utilisé et de la complexité du génome
Que permet l’équation de Clarke et Carbon?
Estimer le nombre de clones à analyser pour trouver une séquence donnée dans une banque génomique
Vrai ou faux
La méthode de fragmentation de l’ADN est peu importante pour la qualité de la banque d’ADN génomique
Faux, Joue un rôle important
Idéalement l’ADN génomique doit être fragmenté ____ dans le but de produire des fragments…
au hasard, qui se recoupent et qui sont d’une longueur appropriée pour le vecteur de clonage
Comment obtient-on habituellement les fragments d’ADN génomique?
par digestion partielle de l’ADN génomique avec des enzymes de restriction coupant fréquemment
Quelles sont les différentes étapes d’un protocole de digestion partielle d’ADN génomique?
- Détermination des conditions de digestion sur une échelle
analytique
a) On digère une quantité constante d’ADN avec des quantités
variables d’enzyme pendant une période donnée, ou on incube
l’ADN avec une quantité constante d’enzyme pendant des périodes
variables
b) La progression des digestions est suivie par électrophorèse sur gel - Digestion partielle d’une grande quantité d’ADN en utilisant les
conditions déterminées précédemment - Fractionnement des fragments de longueurs désirées par
électrophorèse sur gel d’agarose ou centrifugation sur gradient
de sucrose
Que permettent les banques d’ADN génomique construites à partir d’ADN fragmenté de manière aléatoire?
La marche le long d’un chromosome
Pour quoi est utilisée la marche chromosomique?
Pour cloner des gènes liés à des marqueurs polymorphiques
Aussi utilisée pour obtenir la séquence complète d’un gène pour lequel on ne possède qu’un clone de séquence partielle ou un clone d’ADNc
À quoi est directement proportionnelle la longueur des pas effectuées lors de la marche chromosomique?
à la longueur des fragments insérés dans le vecteur
Le fragments utilisé comme sonde ne doit contenir aucune _______ car la marche serait…
séquences répétées, interrompue
Lorsque des promoteurs pour des ARN polymérases de phages sont situés de part et d’autres des insertions…
des sondes d’ARN spécifique aux extrémités peuvent être produites
Une banque d’ADN génomique peut être construite avec quels vecteurs?
vecteur lambda de remplacement, un cosmide ou un vecteur PAc, BAC ou YAC
Pourquoi le vecteur lambda de remplacement est préféré pour la construction de banques d’ADN génomique?
- plus facile à construire et maintenir une banque génomique dans un phage lambda que dans un cosmide
- Criblage de banques génomiques est plus facile à effectuer par hybridation de plages de lyse que par hybridaton de colonies.
Dans quel cas les cosmides sont privilégiés pour la construction de banques d’ADN génomique?
Lorsque le gène désiré ne peut être contenu dans un seul phage lambda recombinant
Pour quoi sont utiles les vecteurs PAC, BAC et YAC dans la contruction de banques d’ADN génomiques?
Pour isoler de très longs segments de chromosome
-construire une série de clones couvrant une grande région d’un génome
Le criblage d’une banque d’ADNc exprimée à l’aide d’un anticorps spécifique à une protéine nécessite ____ plus de clones
Pourquoi?
3-6 fois
Les anticorps ne réagissent qu’avec une sous-classe des clones portant la séquence d’ADNc désiré. Ce sont les clones dans lesquels l’ADNc a été inséré dans le bon cadre de lecture et la bonne orientation
Dans quel contexte les séquences d’ADNc peuvent être exprimées chez E. coli?
Si elles sont clonées en phase avec une gène de fusion porté par le vecteur de clonage
Seulement ____ des clones d’ADNc inséré dans un site de restriction unique du gène de fusion auront la bonne polarité
la moitié
Dans quel cas la totalité des clones d’ADNc auront la bonne polarité?
dans le cas d’un clonage directionnel dans le gène de fusion
Vrai ou faux
Les vecteurs PAC, BAC et YAC d’insertion sont les vecteurs les plus utilisés pour le clonage d’ADNc
Faux, les vecteurs lambda d’insertion
Avant 1983, le clonage d’ADNc se faisait presque
exclusivement dans des _______. Une banque
contenant 1-3 x 10^5 plasmides recombinants était
habituellement produite à partir de _____ d’ADNc
Avant 1983, le clonage d’ADNc se faisait presque
exclusivement dans des vecteurs plasmidiques. Une banque
contenant 1-3 x 105 plasmides recombinants était
habituellement produite à partir de 0.5 à 1.0 µg d’ADNc
synthétiser l’ADNc et la disponibilité grandissante de linkers,
d’adaptateurs, de méthylases et de mélanges d’encapsidation, il
est devenu possible de tirer profit de la grande efficacité des
systèmes d’encapsidation in vitro de l’ADN de λ. Une banque de
106-107 phages recombinants indépendants est habituellement
obtenue à partir de _____ d’ADNc
100 ng
Décrire les caractéristiques/ l’utilité des vecteurs suivant :
λg 10.
λgt11.
λgt22 et 23.
λZAP.
λg 10. Pour le criblage avec des sondes d’acides nucléiques (sélection hfl-)
λgt11. Pour construire des banques qui seront criblées à l’aide d’anticorps.
Le site unique de clonage EcoRI est situé 53 pb en 3’ du codon de
terminaison de lacZ; les ADNc ont une chance sur six d’être exprimés sous
forme de protéines de fusion avec la β-galactosidase. Le promoteur du gène
lacZ est inductible avec de l’IPTG et régulé de manière négative par le
répresseur lac (codé par le gène lacI)
λgt22 et 23. Vecteurs dérivés de λgt11 possédant un site multiple de
clonage. L’ADNc peut être cloné directionnellement dans les sites SalI et
NotI sans qu’il soit nécessaire de le protéger avec des méthylases, puisque
ces sites sont extrêmement rares dans les ADNc d’eucaryotes
λZAP. Ce vecteur est le prototype d’une nouvelle génération de vecteurs. Un
site multiple de clonage comprenant six sites uniques est situé dans le gène
lacZ’ de pBluescript. L’ADNc peut être sous-cloné in vivo dans pBluescript et
des sondes d’ARN complémentaires à l’ADNc peuvent être synthétisées
grâce aux promoteurs de phages T3 et T7
Vrai ou faux
Les protéines de fusion sont produites de manière constitutive à partir de vecteurs lambda d’expression
Faux, ne sont pas
La production de quelles molécules doivent être empêcher durant l’amplification de protéines de fusion?
la production de protéines potentiellement toxiques formées par les phages recombinant
Vrai ou faux
Souvent, il n’est pas nécessaire de produire des banques d’ADNc cloné; on peut simplement analyser les produits PCR formés à partir de l’ARNm
vrai
Vrai ou faux
Deux banques d’ADNc construites par PCR
peuvent être soustraites pour isoler les gènes
spécifiques à une de ces banques
vrai
Vrai ou faux
Le complexe formé entre la biotine et l’avidine est peu stable
Faux, extrêmement stable
