Ch.5 Les banques d'ADN Flashcards
Que faut-il pour cloner un gène d’un organisme donné?
faut disposer d’une banque de clones provenant de cet organisme
Qu’est ce qu’une banque d’ADN
une collection de clones recombinants
Que permet la banque d’ADN?
permet d’isoler et d’analyser des gènes individuels, d’étuider l’organisation des gènes et d’élucider la séquence complète d’un génome
Décrire les caractéristiques des banques d’ADN génomiques
• Sont composées de clones d’ADN recombinant dont
l’ensemble représente tout le matériel génétique de
l’organisme étudié
• Peuvent être construites à partir de n’importe lequel
des tissus d’un organisme multicellulaire
• Contiennent tous les éléments de séquence du
génome : gènes exprimés et non exprimés, exons et
introns, régions promotrices et de terminaison,
séquences intergéniques
Décrire les caractéristiques des banques d’ADNc
• Sont composées de clones d’ADN recombinant dont
l’ensemble représente la population d’ARNm d’un
tissu donné de l’organisme étudié. Des banques
construites à partir de différents tissus d’un même
organisme peuvent donc être radicalement
différentes au niveau de leur composition si les
gènes exprimés dans ces tissus diffèrent
• Ne contiennent que les séquences codantes des
gènes exprimés (sans introns), de même que les
régions 5’-UTR et 3’UTR des ARNm
• Reflètent l’abondance des ARNm dans le tissu étudié
De quoi dépend le nombre de clones requis pour construire une banque d’ADN génomique?
Dépend du vecteur de clonage utilisé et de la complexité du génome
Que permet l’équation de Clarke et Carbon?
Estimer le nombre de clones à analyser pour trouver une séquence donnée dans une banque génomique
Vrai ou faux
La méthode de fragmentation de l’ADN est peu importante pour la qualité de la banque d’ADN génomique
Faux, Joue un rôle important
Idéalement l’ADN génomique doit être fragmenté ____ dans le but de produire des fragments…
au hasard, qui se recoupent et qui sont d’une longueur appropriée pour le vecteur de clonage
Comment obtient-on habituellement les fragments d’ADN génomique?
par digestion partielle de l’ADN génomique avec des enzymes de restriction coupant fréquemment
Quelles sont les différentes étapes d’un protocole de digestion partielle d’ADN génomique?
- Détermination des conditions de digestion sur une échelle
analytique
a) On digère une quantité constante d’ADN avec des quantités
variables d’enzyme pendant une période donnée, ou on incube
l’ADN avec une quantité constante d’enzyme pendant des périodes
variables
b) La progression des digestions est suivie par électrophorèse sur gel - Digestion partielle d’une grande quantité d’ADN en utilisant les
conditions déterminées précédemment - Fractionnement des fragments de longueurs désirées par
électrophorèse sur gel d’agarose ou centrifugation sur gradient
de sucrose
Que permettent les banques d’ADN génomique construites à partir d’ADN fragmenté de manière aléatoire?
La marche le long d’un chromosome
Pour quoi est utilisée la marche chromosomique?
Pour cloner des gènes liés à des marqueurs polymorphiques
Aussi utilisée pour obtenir la séquence complète d’un gène pour lequel on ne possède qu’un clone de séquence partielle ou un clone d’ADNc
À quoi est directement proportionnelle la longueur des pas effectuées lors de la marche chromosomique?
à la longueur des fragments insérés dans le vecteur
Le fragments utilisé comme sonde ne doit contenir aucune _______ car la marche serait…
séquences répétées, interrompue
Lorsque des promoteurs pour des ARN polymérases de phages sont situés de part et d’autres des insertions…
des sondes d’ARN spécifique aux extrémités peuvent être produites
Une banque d’ADN génomique peut être construite avec quels vecteurs?
vecteur lambda de remplacement, un cosmide ou un vecteur PAc, BAC ou YAC
Pourquoi le vecteur lambda de remplacement est préféré pour la construction de banques d’ADN génomique?
- plus facile à construire et maintenir une banque génomique dans un phage lambda que dans un cosmide
- Criblage de banques génomiques est plus facile à effectuer par hybridation de plages de lyse que par hybridaton de colonies.
Dans quel cas les cosmides sont privilégiés pour la construction de banques d’ADN génomique?
Lorsque le gène désiré ne peut être contenu dans un seul phage lambda recombinant
Pour quoi sont utiles les vecteurs PAC, BAC et YAC dans la contruction de banques d’ADN génomiques?
Pour isoler de très longs segments de chromosome
-construire une série de clones couvrant une grande région d’un génome
Le criblage d’une banque d’ADNc exprimée à l’aide d’un anticorps spécifique à une protéine nécessite ____ plus de clones
Pourquoi?
3-6 fois
Les anticorps ne réagissent qu’avec une sous-classe des clones portant la séquence d’ADNc désiré. Ce sont les clones dans lesquels l’ADNc a été inséré dans le bon cadre de lecture et la bonne orientation
Dans quel contexte les séquences d’ADNc peuvent être exprimées chez E. coli?
Si elles sont clonées en phase avec une gène de fusion porté par le vecteur de clonage
Seulement ____ des clones d’ADNc inséré dans un site de restriction unique du gène de fusion auront la bonne polarité
la moitié
Dans quel cas la totalité des clones d’ADNc auront la bonne polarité?
dans le cas d’un clonage directionnel dans le gène de fusion
