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ADN recombinant > Ch.6 Identification de l'ADN recombinant > Flashcards

Ch.6 Identification de l'ADN recombinant Flashcards

1
Q

Qu’est ce que le criblage par complémentation fonctionnelle?

A

Méthode de sélection directe pour identifier des gènes jouant le même rôle qu’un gène muté chez E. coli

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Q

Quelles sont les étapes du criblage par complémentation fonctionnelle?

A
  • Transformation des cellules de E.coli trpA-
  • Expression du gène du plasmide
  • Croissance sur médium minimal
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3
Q

Quels clones sont habituellement cribler?

A

Les clones qui ne peuvent pas être sélectionnés directement

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4
Q

Comment sont effectués les transfert des plages de lyse?

A
  1. Étalement des phages
    Les phages sont étalés sur une cellule-hôte appropriée (~5,000
    phages/boîte de 82 mm) et incubés à 37°C jusqu’à ce que les plages
    soient assez grosses pour donner un bon signal d’hybridation (6-12 h)
  2. Transfert des phages sur membranes
    Une membrane est déposée à la surface de chacune des boîtes et
    laissée en place pendant 1-10 min
    Plusieurs répliques de chaque boîte peuvent être effectuées
    successivement. L’hybridation de deux répliques à une sonde
    d’oligonucléotide est recommandée pour éliminer les faux positifs.
  3. Traitement des membranes
    Elles sont traitées avec une solution de NaOH pour détruire les
    particules de phages et dénaturer l’ADN, neutralisées, lavées et
    séchées à l’air
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Q

Comment sont utilisées les membranes de nitrocellulose?

A
  • ADNsb est transféré en présence d’un tampon de force ionique élevé
  • L’ADN est fixé à la membrane en chauffant à 80C dans un four sous vide.
  • > interactions hydrophobique entre ADN et membrane
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6
Q

Quels sont les désavantages de la membrane de nitrocellulose?

A
  • Les acides nucléiques sont libérés lentement des membranes durant les incubations à haute température au cours de l’hybridation
  • Les membranes deviennent fragiles lorsqu’elles sont séchées et ne peuvent survivre qu’à un ou deux cycles d’hybridation
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7
Q

Comment sont utilisées les membranes de nylon?

A
  • Force ionique non requise pour transférer l’ADN
  • L’ADN est fixé à la membrane par irradiation UV, un traitement qui provoque la formation de liens covalents entre l’ADN et la membrane
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8
Q

Quels sont les avantages principaux d’utiliser des membranes de nylon?

A
  • Très résistantes

- Interactions covalentes avec les acides nucléiques permettent le criblage séquentiel avec plusieurs sondes différentes

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9
Q

Vrai ou faux

On préfère utiliser les membranes de nitrocellulose

A

Faux, nylon

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10
Q

Comment sont détectés les clones désirés après leur transfert sur une membrane?

A

par hybridation avec une sonde d’acide nucléique

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11
Q

Quelles sont les étapes d’une expérience d’hybridation?

A
  1. Pré-hybridation
  2. Hybridation
  3. Lavage
  4. Autoradiographie
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12
Q

Quel est le rôle de la pré-hybridation?

Décrire cette étape brievement

A

La pré-hybridation prévient les interactions
non spécifiques entre la sonde et les
membranes et minimise le bruit de fond
Durant cette étape, les membranes sont incubées
dans une solution de force ionique élevée (6X
SSC) contenant un détergent et des agents
bloquants

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13
Q

Lors de la pré-hybridation, quel est l’agent bloquant le plus souvent utilisé?

A

Le réactif de Denhardt (0.02% BSA, 0.02%
polyvinyl pyrollidone et 0.02% Ficoll 400) est
l’agent bloquant le plus communément utilisé

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14
Q

Qu’arrive-t-il durant l’étape d’hybridation?

A

Les membranes sont incubés en présence de la sonde

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15
Q

De quoi dépend la température d’hybridation?

A

De la nature de la sonde et de son dégré d’homologie avec la séquence cible

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16
Q

La température d’hybridation utilisée est avoisinante, mais plus ____ que la Tm de l’ADN double-brin qui sera formé

A

plus basse

17
Q

Par quels facteurs est affecté l’appariement de la sonde?

A

Appariée : + longueur de la sonde, + %G/C, + force ionique

non-appariée : + température, + formamide, + bases non appariées

18
Q

Que font les lavages?

A

Éliminent l’excès de sonde ainsi que la sonde qui s’est appariée avec des séquences apparentées, mais non homologues

19
Q

Quels sont les deux types de lavages?

A
  • non stringent pour enlever l’excès de sonde

- plus stringents pour éliminer les hybrides mésappariés

20
Q

Qu’est ce qui détermine le degré de stringence des lavages?

A

-Concentration en sels
-La température
+ stingente = diminue [sels] et augmente température

21
Q

Vrai ou faux
Il est difficile d’obtenir des clones positifs purs et non contaminés par des clones avoisinants en une seule étape de criblage

A

Vrai

22
Q

Par quoi différent les différents protocoles pour l’hybridation en phase mixte?

A
  • solvant et température utilisées
  • Type d’agent bloquant
  • La concentration de la sonde et l’activité spécifique
  • L’utilisation de composés tels que le sulfate de dextran ou le polyéthylène glycol pour augmenter la vitesse de réassociation des acides nucléiques
  • Stringence des lavages
23
Q

Vrai ou faux

Le choix d’une méthode d’hybridation est un choix personel

A

Vrai

24
Q

Vrai ou faux

Les sondes d’hybridation peuvent être marquées par des étiquettes non radioactives

A

Vrai

25
Q

par quoi sera identifier le clone codant pour une protéine dont l’on connait une partie de la séquence en acides aminés?

A

Par criblage avec une sonde d’oligonucléotides

26
Q

Comment choisir un mélange d’oligonucléotides dégénérés?

A

En cherchant la région qui est spécifique par le nombre minimal de codons.
Il faut :
-Trouver les régions riches en acides aminés qui sont spécifiées par 1 ou 2 codons
-Éviter les régions riches en a.a avec 6 codons possibles (leu, ser, arg)

27
Q

Quelle doit être la longueur des oligonucléotides dégénérés?

A
  • Suffisamment longuues pour être uniques dans le génome étudié (12 E. coli, 17 mammifères)
  • Suffisamment courtes pour distinguer les oligonucléotides parfaitement appariés de ceux qui ne le sont pas lors des hybridation (max 20)

12/17-20

28
Q

Vrai ou faux

Seulement un oligonucléotide dégénéré de la population d’oligonucléotide donne la bonne séquence

A

Vrai

29
Q

Que doit-on connaitre pour fabriquer des «guessmers»?

A

La fréquence d’utilisation de codons dans le génome étudié

30
Q

Que doit-on connaitre pour fabriquer une sonde composée d’un fragment PCR?

A

Les séquences de deux régions différentes de la protéine étudiée

31
Q

Que permet le criblage différentiel?

A

Permet d’identifier une famille de gènes qui sont exprimés dans les mêmes conditions

32
Q

Quelles sont les deux populaitons cellulaires différentes nécessaires pour le criblage différentiel?

A

une dans laquelle la famille de gènes est exprimée et l’autre dans laquelle elle ne l’est pas

33
Q

Que peut être la famille de gènes exprimés dans les mêmes conditions lors du criblage différentiel?

A

• Il peut s’agir de gènes exprimés spécifiquement dans certains
tissus ou à certains stades du développement, ou bien encore,
de gènes dont l’expression est régulée par des facteurs de
croissance ou induite par un agent donné

34
Q

Quelles sont les deux sondes d’ADNc utilisées pour hybrider une banque d’ADNc dans le criblage différentiel?

A
  • une sonde provenant de la population +

- Une sonde provenant de la population -

35
Q

Les anticorps dirigés contre une protéine peuvent être utilisés pour…

A

identifier le gène codant pour cette protéine

36
Q

Si une protéine se lie spécifiquement à un ligand…

A

une banque d’expression pourra être criblée avec ce ligand pour identifier le gène

37
Q

Quels sont les 2 types de ligands?

A

– Un composé ou une protéine de bas poids moléculaire ayant une
grande affinité pour la protéine d’intérêt (e.g. AMPc32P)
– Une petite séquence d’ADN reconnue par la protéine d’intérêt (e.g.
la séquence reconnue par un facteur de transcription). Un
oligonucléotide double-brin marqué au 32P contenant un ou
plusieurs sites de reconnaissance de la protéine est alors utilisé
pour le criblage

38
Q

Quels sont les conditions à respecter lors de la création d’une banque d’expression avec un ligand?

A

– Le ligand doit avoir une grande affinité pour la protéine
– Il doit se lier à des acides aminés contigus sur la séquence
– La protéine ne doit pas avoir besoin d’être modifiée ou d’être
présente sous forme d’hétérodimères pour se lier au ligand

ADN recombinant (8 decks)

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