Ch.6 Identification de l'ADN recombinant Flashcards
Qu’est ce que le criblage par complémentation fonctionnelle?
Méthode de sélection directe pour identifier des gènes jouant le même rôle qu’un gène muté chez E. coli
Quelles sont les étapes du criblage par complémentation fonctionnelle?
- Transformation des cellules de E.coli trpA-
- Expression du gène du plasmide
- Croissance sur médium minimal
Quels clones sont habituellement cribler?
Les clones qui ne peuvent pas être sélectionnés directement
Comment sont effectués les transfert des plages de lyse?
- Étalement des phages
Les phages sont étalés sur une cellule-hôte appropriée (~5,000
phages/boîte de 82 mm) et incubés à 37°C jusqu’à ce que les plages
soient assez grosses pour donner un bon signal d’hybridation (6-12 h) - Transfert des phages sur membranes
Une membrane est déposée à la surface de chacune des boîtes et
laissée en place pendant 1-10 min
Plusieurs répliques de chaque boîte peuvent être effectuées
successivement. L’hybridation de deux répliques à une sonde
d’oligonucléotide est recommandée pour éliminer les faux positifs. - Traitement des membranes
Elles sont traitées avec une solution de NaOH pour détruire les
particules de phages et dénaturer l’ADN, neutralisées, lavées et
séchées à l’air
Comment sont utilisées les membranes de nitrocellulose?
- ADNsb est transféré en présence d’un tampon de force ionique élevé
- L’ADN est fixé à la membrane en chauffant à 80C dans un four sous vide.
- > interactions hydrophobique entre ADN et membrane
Quels sont les désavantages de la membrane de nitrocellulose?
- Les acides nucléiques sont libérés lentement des membranes durant les incubations à haute température au cours de l’hybridation
- Les membranes deviennent fragiles lorsqu’elles sont séchées et ne peuvent survivre qu’à un ou deux cycles d’hybridation
Comment sont utilisées les membranes de nylon?
- Force ionique non requise pour transférer l’ADN
- L’ADN est fixé à la membrane par irradiation UV, un traitement qui provoque la formation de liens covalents entre l’ADN et la membrane
Quels sont les avantages principaux d’utiliser des membranes de nylon?
- Très résistantes
- Interactions covalentes avec les acides nucléiques permettent le criblage séquentiel avec plusieurs sondes différentes
Vrai ou faux
On préfère utiliser les membranes de nitrocellulose
Faux, nylon
Comment sont détectés les clones désirés après leur transfert sur une membrane?
par hybridation avec une sonde d’acide nucléique
Quelles sont les étapes d’une expérience d’hybridation?
- Pré-hybridation
- Hybridation
- Lavage
- Autoradiographie
Quel est le rôle de la pré-hybridation?
Décrire cette étape brievement
La pré-hybridation prévient les interactions
non spécifiques entre la sonde et les
membranes et minimise le bruit de fond
Durant cette étape, les membranes sont incubées
dans une solution de force ionique élevée (6X
SSC) contenant un détergent et des agents
bloquants
Lors de la pré-hybridation, quel est l’agent bloquant le plus souvent utilisé?
Le réactif de Denhardt (0.02% BSA, 0.02%
polyvinyl pyrollidone et 0.02% Ficoll 400) est
l’agent bloquant le plus communément utilisé
Qu’arrive-t-il durant l’étape d’hybridation?
Les membranes sont incubés en présence de la sonde
De quoi dépend la température d’hybridation?
De la nature de la sonde et de son dégré d’homologie avec la séquence cible
La température d’hybridation utilisée est avoisinante, mais plus ____ que la Tm de l’ADN double-brin qui sera formé
plus basse
Par quels facteurs est affecté l’appariement de la sonde?
Appariée : + longueur de la sonde, + %G/C, + force ionique
non-appariée : + température, + formamide, + bases non appariées
Que font les lavages?
Éliminent l’excès de sonde ainsi que la sonde qui s’est appariée avec des séquences apparentées, mais non homologues
Quels sont les deux types de lavages?
- non stringent pour enlever l’excès de sonde
- plus stringents pour éliminer les hybrides mésappariés
Qu’est ce qui détermine le degré de stringence des lavages?
-Concentration en sels
-La température
+ stingente = diminue [sels] et augmente température
Vrai ou faux
Il est difficile d’obtenir des clones positifs purs et non contaminés par des clones avoisinants en une seule étape de criblage
Vrai
Par quoi différent les différents protocoles pour l’hybridation en phase mixte?
- solvant et température utilisées
- Type d’agent bloquant
- La concentration de la sonde et l’activité spécifique
- L’utilisation de composés tels que le sulfate de dextran ou le polyéthylène glycol pour augmenter la vitesse de réassociation des acides nucléiques
- Stringence des lavages
Vrai ou faux
Le choix d’une méthode d’hybridation est un choix personel
Vrai
Vrai ou faux
Les sondes d’hybridation peuvent être marquées par des étiquettes non radioactives
Vrai
par quoi sera identifier le clone codant pour une protéine dont l’on connait une partie de la séquence en acides aminés?
Par criblage avec une sonde d’oligonucléotides
Comment choisir un mélange d’oligonucléotides dégénérés?
En cherchant la région qui est spécifique par le nombre minimal de codons.
Il faut :
-Trouver les régions riches en acides aminés qui sont spécifiées par 1 ou 2 codons
-Éviter les régions riches en a.a avec 6 codons possibles (leu, ser, arg)
Quelle doit être la longueur des oligonucléotides dégénérés?
- Suffisamment longuues pour être uniques dans le génome étudié (12 E. coli, 17 mammifères)
- Suffisamment courtes pour distinguer les oligonucléotides parfaitement appariés de ceux qui ne le sont pas lors des hybridation (max 20)
12/17-20
Vrai ou faux
Seulement un oligonucléotide dégénéré de la population d’oligonucléotide donne la bonne séquence
Vrai
Que doit-on connaitre pour fabriquer des «guessmers»?
La fréquence d’utilisation de codons dans le génome étudié
Que doit-on connaitre pour fabriquer une sonde composée d’un fragment PCR?
Les séquences de deux régions différentes de la protéine étudiée
Que permet le criblage différentiel?
Permet d’identifier une famille de gènes qui sont exprimés dans les mêmes conditions
Quelles sont les deux populaitons cellulaires différentes nécessaires pour le criblage différentiel?
une dans laquelle la famille de gènes est exprimée et l’autre dans laquelle elle ne l’est pas
Que peut être la famille de gènes exprimés dans les mêmes conditions lors du criblage différentiel?
• Il peut s’agir de gènes exprimés spécifiquement dans certains
tissus ou à certains stades du développement, ou bien encore,
de gènes dont l’expression est régulée par des facteurs de
croissance ou induite par un agent donné
Quelles sont les deux sondes d’ADNc utilisées pour hybrider une banque d’ADNc dans le criblage différentiel?
- une sonde provenant de la population +
- Une sonde provenant de la population -
Les anticorps dirigés contre une protéine peuvent être utilisés pour…
identifier le gène codant pour cette protéine
Si une protéine se lie spécifiquement à un ligand…
une banque d’expression pourra être criblée avec ce ligand pour identifier le gène
Quels sont les 2 types de ligands?
– Un composé ou une protéine de bas poids moléculaire ayant une
grande affinité pour la protéine d’intérêt (e.g. AMPc32P)
– Une petite séquence d’ADN reconnue par la protéine d’intérêt (e.g.
la séquence reconnue par un facteur de transcription). Un
oligonucléotide double-brin marqué au 32P contenant un ou
plusieurs sites de reconnaissance de la protéine est alors utilisé
pour le criblage
Quels sont les conditions à respecter lors de la création d’une banque d’expression avec un ligand?
– Le ligand doit avoir une grande affinité pour la protéine
– Il doit se lier à des acides aminés contigus sur la séquence
– La protéine ne doit pas avoir besoin d’être modifiée ou d’être
présente sous forme d’hétérodimères pour se lier au ligand
