Ch.2 Les techniques autres que la restriction d'ADN pour produire des segments Flashcards
Quels sont les autres méthodes (que le ch. 1) disponibles pour générer des fragments d’ADN qui seront utilisés pour le clonage?
- Synthèse chimique d’ADN
- Synthèse d’ADNc
- PCR
Comment sont d’abord obtenus les fragments lors des techniques de séquencage de masse?
Par bris mécanique
Quelles sont les conditions pour la synthèse chimique d’oligonucléotides?
effectuée en phase solide, solvant non-aqueux
Vrai ou faux
Synthèse d’oligonucléotides
a) La synthèse est effectuée de 5’ -> 3’
b) La chaine d’ADN en croissance est attachée à la surface de billes contenues dans les puits ou sur une plaque de silice
c) La longueur minimum des oligonucléotides est de 250 (nt)
d) La synthèse est rapide
e) efficacité de couplage est <90%
f) Les oligonucléotides sont tous phosphorylé en 5’
g) Seulement la synthèse d’ADN est possible
a) faux, 3’->5’
b) vrai
c) faux, maximum
d) vrai 3min/nt
e) Faux, 99.5%
f) faux pas phospho
g) Faux, ARN
Pourquoi n’est-il pas possible de faire une synthèse d’oligonucléotide plus longue (limite)?
parce que l’efficacité de couplage n’est pas 100%
La synthèse d’ARN est souvent utile pour…
Inactiver un gène, inhiber une expression
Pourquoi les solvants d’un synthétiseur d’ADN sont sous atmosphère d’hélium ou d’argon?
Sensible à l’oxydation et à l’humidité
Le nucléoside ajouté à chaque cycle contient quoi à ses extrémités?
5’ OH = groupement protecteur
3’ OH = groupement activateur
À quoi sert le groupement protecteur?
empêcher les différentes molécules de nucléoside dans le réactif de réagir entres elles
Quelles sont les quatres étapes d’un cycle de synthèse d’un oligonucléotide?
- Détritylation
- Activation et addition
- Capping
- Oxydation
Vrai ou faux
Le premier nucléoside est fixé au support par un lien covalent
Vrai
Par quoi le groupement 5’ OH est-il protéger?
DMT
Les groupement NH2 sont…
protégés avec des groupements chimiques
Qu’arrive-t-il durant la détritylation?
Le groupement DMT est libérer de l’extrémité 5’
Qu’arrive-t-il durant l’étape d’activation?
l’amine tertiaire fixée sur le groupement phosphoramidite du deuxième nucléoside est protoné par le tétrazole
Qu’arrive-t-il durant l’étape d’addition?
Le groupement 5’ OH du premier nucléoside attaque le groupement phosphite trivalent du deuxième nucléotide -> élimination de l’amine tertiaire
Qu’arrive-t-il pendant l’étape de capping?
Acétilation des groupements 5’ OH des chaines qui n’ont pas subi la réaction d’addition
Qu’arrive-t-il durant l’étape d’oxydation?
Le groupement phosphite trivalent est oxydé en phosphate pentavalent par I2 + H2O, le cycle d’addition du troisième nucléoside peut commencer
Vrai ou faux
Il est possible d’ajouter plus d’un nucléoside dans un cycle de manière à former un oligo dégénérer
Vrai
Que fait le groupement benzoide?
protège grp amine
Quelles sont les particularités des monomères utilisés pour synthétiser des oligonucléotides?
- soluble dans des solvants non-aqueux
- Seule réaction possible = addition séquentielle 3’-> 5’
- Fonctions aminées des base protégées
- Groupement 5’ OH protégé
- 3’ OH couplé avec le groupement hautement réactif phosphoramidite, atome O du phosphite masqué par un groupement protecteur b-cyanoéthyl
Vrai ou faux
À la fin de la synthèse tous les groupements protecteurs sont partis
Faux, grp benzoyle, isobutyryle, DMT et b-cyanoéthyl encore présent
Vrai ou faux
Lorsque la taille de l’oligo augmente, le rendement augmente aussi
Faux contraire
Quel groupement n’est pas décroché de l’oligo à la fin et pourquoi?
Dernier groupement DMT
car il facilite la purification par chromatographie en phase inverse