Ch3 La ligature des fragments d'ADN Flashcards
Vrai ou faux
La ligature est l’étape finale de la construction d’une molécule d’ADN recombinant
Vrai
La ligase du phage ___ est utilisée dans la stratégie _____ de clonage
T4, conventionnelle
Entre quels groupement la ligase crée des liens ______
Phosphodiesters
5’ Phosphate et 3’ OH
Quelle est la température optimale pour la ligase T4?
37
Quel cofacteur est requis pour l’activité d’une ligase?
En quoi est converti ce cofateur?
ATP, en AMP et PPi
Quelle est la fonction naturelle d’une ligase?
Souder les discontinuités dans l’ADN en créant un lien phosphodiester entre 5’ p et 3’ OH
Quels sont les points à considérer pour la ligature dans un clonage conventionnel?
- Conditions différentes pour les ligatures de fragments avec bouts collants et francs
- Influence de la concentration et de la longueur des fragments sur le type de produits formés dans les réactions de ligature de fragments avec bouts collants
- Méthode pour prévenir la circularisation du vecteur
- Stratégies de ligature de fragments avec bouts francs
Vrai ou faux
La ligature de fragments avec des bouts francs est plus efficace
Faux
Les conditions utilisées pour la ligature doivent favoriser…
l’association des séquences simple brin qui sont complémentaires
Pourquoi la température lors de la ligature de bouts francs n’est pas un problème?
Parce que il n’y a pas d’hybridation donc pas de Tm.
Vrai ou faux
Les extrémités collantes générer par les enzymes de restriction ne s’apparient pas à 37 C
Vrai
À quelle température doit-on faire la réaction de ligature?
Pourquoi?
Une température entre 8-37 C
Compromis entre la température optimale pour la ligase et la température d’appariement des bouts collants
Vrai ou faux
Des agents comme PEG peuvent favoriser l’appariement des bouts collants
Vrai
Quelle est la température recommandée pour la ligature de fragments avec des extrémitées collantes générées par EcoR1?
12-16
Quelles conditions changent entre la ligature de bouts collants et francs?
Pour collants : [ATP] plus faible -> peut réverser réaction [E] plus grande [S] plus grande PEG accélère réaction
Quel est le mécanisme réactionnel de l’ADN ligase du phage T4?
- Le groupement adénylate de l’ATP se lie sur un résidu Lys présent dans le site actif de l’enzyme, puis est transféré sur le groupement 5’ phosphate de l’ADN
- Attaque nucléophile par le groupement 3’-OH
- Réaction favorisé dans la cellule à cause de la forte activité pyrophosphatase
Quelle est la différence entre l’ADN ligase T4 et E. coli?
E.coli utilise NAD+ au lieu de ATP
Vrai ou faux
La ligature d’un vecteur n’est jamais 100% efficace
Vrai
Environ 30%, Gibson = environ 90%
Quels sont les conditions pour qu’un produit se réplique chez E. coli?
- Avoir une origine de réplication
- être circulaire
Que permet l’expression graphique des équations de Dugaiczyk?
Permet de prédire quels types de produits seront formés durant la ligature d’un fragments d’ADN à différentes concentrations
Qu’est ce que j dans l’expression graphique des équations de Dugaiczyk?
i?
j : concentration effective d’une des extrémités d’une molécule d’ADN dans le voisinage de l’autre extrémité de la même molécule
i : concentration totale des extrémités d’ADN
que favorise un ratio j/i faible?
Quels types d’interactions sont favorisées lorsque j augmente?
Lorsqu’il diminue?
Les molécules d’ADN plus grande ont un j…
Favorise les interactions intermoléculaires
interactions intramoléculaire
interaction intermoléculaire
j - grand
Qu’arrive-t-il quand j/i =2?
Transition entre la formation de monomères circulaires et la formation de concatémères linéaires
Pour quoi est utile le graphique de Dugaiczyk?
prédire les évènements initiaux de la réaction de ligature
La ligature d’ADN est plutôt une série de réactions ______ ou chaque évènement modifie le rapport ____ pour le reste des molécules non ligaturées
individuelles, j/i
Quelles sont les conditions recommandées pour ligaturer un insert avec un vecteur plasmidique?
[ADN]totale < 10ug/ml
Rapport insert : vecteur de 2:1 ou 3:1
Vrai ou faux
Dans des conditions optimales le vecteur recirculariser représente le produit majoritaire
Vrai
Quelles sont les trois stratégies utilisées pour prévenir la circularisation du vecteur dans les réactions de ligature?
Explique chacune des méthodes
- Déphosphorylation du vecteur
Le vecteur est coupé avec une seule enzyme de restriction (ER),
puis est déphosphorylé avec la phosphatase alcaline avant d’être
ligaturé avec les fragments. - Clonage directionnel
Le vecteur est coupé avec 2 ER qui génèrent des bouts
incompatibles - Remplissage partiel dʼextrémités 5ʼ protubérantes
incompatibles
Le vecteur est coupé avec une ER qui génère des extrémités
collantes 5’ avec un dépassant de 4 nt. Les fragments qu’on désire
cloner portent le même type d’extrémités mais elles sont
incompatibles avec celles du vecteur. Pour les rendre compatibles, il
faut ajouter 2 nucléotides en utilisant le fragment Klenow
Vrai ou faux
Pour la ligature, les deux fragments d’ADN doivent avoir des groupement 5’-phosphate
Faux seulement 1
Quel est le principal avantage de la méthode de remplissage partiel?
Les fragments que l’on désire insérer ne peuvent s’associer entres eux, ce qui prévient l’insertion de plus d’un fragments dans le vecteur
Quels sont les désavantages de la ligature de fragments à extrémités franches?
- Ce type de ligature est inefficace
- Les sites de restriction aux jonctions du vecteur et de
l’insertion peuvent être éliminés - Les molécules recombinantes peuvent contenir plusieurs
copies de l’insertion en tandem
Quelle stratégie peut-on utiliser pour éviter de faire une ligature de fragments à extrémités franche?
Utiliser des linkers ou des adaptateurs
Quelle est la différence entre les linkers et les adaptateurs?
Les ʻlinkersʼ sont toujours ajoutés à des insertions portant
des bouts francs, alors que les adaptateurs peuvent
aussi être ajoutés à des insertions portant des bouts
collants pour les rendre compatibles avec les extrémités
du vecteur
Vrai ou faux
Les linkers doivent être déphosphorylés à leur extrémité 5’ avant d’être utilisés
Quel enzyme et quel cofacteur sont utilisés pour cette réaction?
Faux, phosphorylés
polynucléotide kinase du phage T4 avec ATP
Dans quel contexte l’utilisation de linkers peut être problématique?
Quelles sont les solutions?
Quand les sites présents dans ces molécules se retrouvent aussi dans les fragments à cloner
- Traiter les fragments avec des méthylases avant la ligature
- Utiliser un adaptateur
Les adaptateurs sont généralement composés de ______ et (sont/ ne sont pas) coupés avec une enzyme de restriction lors de leur utilisation
deux oligonucléotides différents ne sont pas
Vrai ou faux
L’extrémité 5’ de l’oligo de l’adaptateur doit être phosphorylé
Vrai
Quels sont les avantages des adaptateurs?
- La polymérisation de l’adaptateur est évitée en ne
phosphorylant qu’une seule des extrémités 5’
(lʼextrémité que l’on veut lier à l’ADN cloné) - Un fragment généré par une enzyme donnée peut
être cloné dans un vecteur digéré par une enzyme
différente qui génère des extrémités incompatibles - Des sites de restriction internes peuvent être ajoutés
pour faciliter l’excision de l’insertion - L’utilisation des adaptateurs n’est pas limitée au
clonage; ils servent pour le séquençage en masse
Vrai ou faux
Les adaptateurs sont utiles pour le séquencage de masse
vrai
Nomme un avantage de la méthode de clonage basé sur la complémentarité de queues d’homopolymères
Les liens formés entre les séquences d’homopolymères complémentaires du vecteur et des fragments à cloner sont stables à température pièce
-pas besoin de réparer les brèches avant la transformation
Sur quoi est basé la stratégie de clonage dans un vecteur TOPO?
Que contient une trousse de clonage TOPO?
sur la topoisomérase I du virus de la vaccine
un vecteur linéarisé portant une molécule de topoisomérase I à chacune de ses extrémités 3’ phosphate
Qu’arrive-t-il quand le vecteur TOPO est mélangé avec le fragment d’ADN à cloner?
l’enzyme créer des liens covalents entre les extrémités 3’ phosphate et 5’ OH
Pourquoi la réaction avec la topoisomérase est plus rapide et efficace qu’une réaction de ligature conventionnelle?
Puisque la topoisomérase I est déjà attachée au vecteur, la réaction
ne requiert que l’interaction de deux molécules et est donc beaucoup
plus rapide et efficace qu’une réaction de ligature conventionnelle qui
nécessite l’interaction de trois molécules
Quelle est la différence au niveau du fragment d’ADN ligaturer lors d’une réaction TOPO?
l’ADN ligaturé par la topoisomérase ne doit pas avoir de groupement 5’ phosphate
Comment fonctionne la topoisomérase?
La topoisomérase I reconnaît la séquence 5’-C/TCCTT-3’ et coupe le lien phosphodiester
immédiatement après cette séquence sur un seul brin. Sous sa forme circulaire, le vecteur
contient deux copies de cette séquence (sur différents brins)
