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ADN recombinant > Ch3 La ligature des fragments d'ADN > Flashcards

Ch3 La ligature des fragments d'ADN Flashcards

1
Q

Vrai ou faux

La ligature est l’étape finale de la construction d’une molécule d’ADN recombinant

A

Vrai

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Q

La ligase du phage ___ est utilisée dans la stratégie _____ de clonage

A

T4, conventionnelle

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3
Q

Entre quels groupement la ligase crée des liens ______

A

Phosphodiesters

5’ Phosphate et 3’ OH

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4
Q

Quelle est la température optimale pour la ligase T4?

A

37

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5
Q

Quel cofacteur est requis pour l’activité d’une ligase?

En quoi est converti ce cofateur?

A

ATP, en AMP et PPi

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6
Q

Quelle est la fonction naturelle d’une ligase?

A

Souder les discontinuités dans l’ADN en créant un lien phosphodiester entre 5’ p et 3’ OH

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7
Q

Quels sont les points à considérer pour la ligature dans un clonage conventionnel?

A
  • Conditions différentes pour les ligatures de fragments avec bouts collants et francs
  • Influence de la concentration et de la longueur des fragments sur le type de produits formés dans les réactions de ligature de fragments avec bouts collants
  • Méthode pour prévenir la circularisation du vecteur
  • Stratégies de ligature de fragments avec bouts francs
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8
Q

Vrai ou faux

La ligature de fragments avec des bouts francs est plus efficace

A

Faux

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9
Q

Les conditions utilisées pour la ligature doivent favoriser…

A

l’association des séquences simple brin qui sont complémentaires

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10
Q

Pourquoi la température lors de la ligature de bouts francs n’est pas un problème?

A

Parce que il n’y a pas d’hybridation donc pas de Tm.

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11
Q

Vrai ou faux

Les extrémités collantes générer par les enzymes de restriction ne s’apparient pas à 37 C

A

Vrai

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12
Q

À quelle température doit-on faire la réaction de ligature?

Pourquoi?

A

Une température entre 8-37 C

Compromis entre la température optimale pour la ligase et la température d’appariement des bouts collants

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13
Q

Vrai ou faux

Des agents comme PEG peuvent favoriser l’appariement des bouts collants

A

Vrai

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14
Q

Quelle est la température recommandée pour la ligature de fragments avec des extrémitées collantes générées par EcoR1?

A

12-16

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15
Q

Quelles conditions changent entre la ligature de bouts collants et francs?

A 
Pour collants : 
[ATP] plus faible -> peut réverser réaction
[E] plus grande 
[S] plus grande 
PEG accélère réaction
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16
Q

Quel est le mécanisme réactionnel de l’ADN ligase du phage T4?

A
  • Le groupement adénylate de l’ATP se lie sur un résidu Lys présent dans le site actif de l’enzyme, puis est transféré sur le groupement 5’ phosphate de l’ADN
  • Attaque nucléophile par le groupement 3’-OH
  • Réaction favorisé dans la cellule à cause de la forte activité pyrophosphatase
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17
Q

Quelle est la différence entre l’ADN ligase T4 et E. coli?

A

E.coli utilise NAD+ au lieu de ATP

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18
Q

Vrai ou faux

La ligature d’un vecteur n’est jamais 100% efficace

A

Vrai

Environ 30%, Gibson = environ 90%

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19
Q

Quels sont les conditions pour qu’un produit se réplique chez E. coli?

A
  • Avoir une origine de réplication

- être circulaire

20
Q

Que permet l’expression graphique des équations de Dugaiczyk?

A

Permet de prédire quels types de produits seront formés durant la ligature d’un fragments d’ADN à différentes concentrations

21
Q

Qu’est ce que j dans l’expression graphique des équations de Dugaiczyk?
i?

A

j : concentration effective d’une des extrémités d’une molécule d’ADN dans le voisinage de l’autre extrémité de la même molécule
i : concentration totale des extrémités d’ADN

22
Q

que favorise un ratio j/i faible?
Quels types d’interactions sont favorisées lorsque j augmente?
Lorsqu’il diminue?
Les molécules d’ADN plus grande ont un j…

A

Favorise les interactions intermoléculaires
interactions intramoléculaire
interaction intermoléculaire
j - grand

23
Q

Qu’arrive-t-il quand j/i =2?

A

Transition entre la formation de monomères circulaires et la formation de concatémères linéaires

24
Q

Pour quoi est utile le graphique de Dugaiczyk?

A

prédire les évènements initiaux de la réaction de ligature

25
Q

La ligature d’ADN est plutôt une série de réactions ______ ou chaque évènement modifie le rapport ____ pour le reste des molécules non ligaturées

A

individuelles, j/i

26
Q

Quelles sont les conditions recommandées pour ligaturer un insert avec un vecteur plasmidique?

A

[ADN]totale < 10ug/ml

Rapport insert : vecteur de 2:1 ou 3:1

27
Q

Vrai ou faux

Dans des conditions optimales le vecteur recirculariser représente le produit majoritaire

A

Vrai

28
Q

Quelles sont les trois stratégies utilisées pour prévenir la circularisation du vecteur dans les réactions de ligature?
Explique chacune des méthodes

A
  1. Déphosphorylation du vecteur
    Le vecteur est coupé avec une seule enzyme de restriction (ER),
    puis est déphosphorylé avec la phosphatase alcaline avant d’être
    ligaturé avec les fragments.
  2. Clonage directionnel
    Le vecteur est coupé avec 2 ER qui génèrent des bouts
    incompatibles
  3. Remplissage partiel dʼextrémités 5ʼ protubérantes
    incompatibles
    Le vecteur est coupé avec une ER qui génère des extrémités
    collantes 5’ avec un dépassant de 4 nt. Les fragments qu’on désire
    cloner portent le même type d’extrémités mais elles sont
    incompatibles avec celles du vecteur. Pour les rendre compatibles, il
    faut ajouter 2 nucléotides en utilisant le fragment Klenow
29
Q

Vrai ou faux

Pour la ligature, les deux fragments d’ADN doivent avoir des groupement 5’-phosphate

A

Faux seulement 1

30
Q

Quel est le principal avantage de la méthode de remplissage partiel?

A

Les fragments que l’on désire insérer ne peuvent s’associer entres eux, ce qui prévient l’insertion de plus d’un fragments dans le vecteur

31
Q

Quels sont les désavantages de la ligature de fragments à extrémités franches?

A
  1. Ce type de ligature est inefficace
  2. Les sites de restriction aux jonctions du vecteur et de
    l’insertion peuvent être éliminés
  3. Les molécules recombinantes peuvent contenir plusieurs
    copies de l’insertion en tandem
32
Q

Quelle stratégie peut-on utiliser pour éviter de faire une ligature de fragments à extrémités franche?

A

Utiliser des linkers ou des adaptateurs

33
Q

Quelle est la différence entre les linkers et les adaptateurs?

A

Les ʻlinkersʼ sont toujours ajoutés à des insertions portant
des bouts francs, alors que les adaptateurs peuvent
aussi être ajoutés à des insertions portant des bouts
collants pour les rendre compatibles avec les extrémités
du vecteur

34
Q

Vrai ou faux

Les linkers doivent être déphosphorylés à leur extrémité 5’ avant d’être utilisés

Quel enzyme et quel cofacteur sont utilisés pour cette réaction?

A

Faux, phosphorylés

polynucléotide kinase du phage T4 avec ATP

35
Q

Dans quel contexte l’utilisation de linkers peut être problématique?
Quelles sont les solutions?

A

Quand les sites présents dans ces molécules se retrouvent aussi dans les fragments à cloner

  1. Traiter les fragments avec des méthylases avant la ligature
  2. Utiliser un adaptateur
36
Q

Les adaptateurs sont généralement composés de ______ et (sont/ ne sont pas) coupés avec une enzyme de restriction lors de leur utilisation

A

deux oligonucléotides différents ne sont pas

37
Q

Vrai ou faux

L’extrémité 5’ de l’oligo de l’adaptateur doit être phosphorylé

A

Vrai

38
Q

Quels sont les avantages des adaptateurs?

A
  1. La polymérisation de l’adaptateur est évitée en ne
    phosphorylant qu’une seule des extrémités 5’
    (lʼextrémité que l’on veut lier à l’ADN cloné)
  2. Un fragment généré par une enzyme donnée peut
    être cloné dans un vecteur digéré par une enzyme
    différente qui génère des extrémités incompatibles
  3. Des sites de restriction internes peuvent être ajoutés
    pour faciliter l’excision de l’insertion
  4. L’utilisation des adaptateurs n’est pas limitée au
    clonage; ils servent pour le séquençage en masse
39
Q

Vrai ou faux

Les adaptateurs sont utiles pour le séquencage de masse

A

vrai

40
Q

Nomme un avantage de la méthode de clonage basé sur la complémentarité de queues d’homopolymères

A

Les liens formés entre les séquences d’homopolymères complémentaires du vecteur et des fragments à cloner sont stables à température pièce
-pas besoin de réparer les brèches avant la transformation

41
Q

Sur quoi est basé la stratégie de clonage dans un vecteur TOPO?
Que contient une trousse de clonage TOPO?

A

sur la topoisomérase I du virus de la vaccine

un vecteur linéarisé portant une molécule de topoisomérase I à chacune de ses extrémités 3’ phosphate

42
Q

Qu’arrive-t-il quand le vecteur TOPO est mélangé avec le fragment d’ADN à cloner?

A

l’enzyme créer des liens covalents entre les extrémités 3’ phosphate et 5’ OH

43
Q

Pourquoi la réaction avec la topoisomérase est plus rapide et efficace qu’une réaction de ligature conventionnelle?

A

Puisque la topoisomérase I est déjà attachée au vecteur, la réaction
ne requiert que l’interaction de deux molécules et est donc beaucoup
plus rapide et efficace qu’une réaction de ligature conventionnelle qui
nécessite l’interaction de trois molécules

44
Q

Quelle est la différence au niveau du fragment d’ADN ligaturer lors d’une réaction TOPO?

A

l’ADN ligaturé par la topoisomérase ne doit pas avoir de groupement 5’ phosphate

45
Q

Comment fonctionne la topoisomérase?

A

La topoisomérase I reconnaît la séquence 5’-C/TCCTT-3’ et coupe le lien phosphodiester
immédiatement après cette séquence sur un seul brin. Sous sa forme circulaire, le vecteur
contient deux copies de cette séquence (sur différents brins)

ADN recombinant (8 decks)

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