Ch.7 Le séquencage d'ADN Flashcards
Quelles sont les quatres étapes du séquencages par la méthode de sanger?
- Réaction de séquencage
- Électrophorèse des produits de réaction sur gel de séquence
- Détection des fragments d’ADN
- Lecture de la séquence
Quel est le résultat de l’incorporation d’un didésoxyribonucléotide dans une chaine d’ADN en réplication?
Bloque la croissance de cette chaine
Les réactions de séquençage génèrent ________ qui partagent une extrémité commune et qui différent…
Les réactions de séquençage génèrent une série de chaînes dʼADN simple-brin qui partagent une extrémité commune et qui différent à l'autre extrémité pour chaque base successive
Dans quelle condition le séquencage d’ADN peut être effectué dans un seul tube?
Lorsque les chaines terminées par différents ddNTPs peuvent être distinguées
Comment fait-on pour distinguerles bases aux extrémités des chaines?
Chaque ddNTP doit être couplé avec un colorant qui émet une fluorescence à une longueur d’onde qui lui est propre
Les gels de séquence peuvent séparer des chaines d’ADNsb dont les longueurs ne diffèrent…
que par une seule base
Quelles sont les caractéristiques des gels de séquence?
– sont constitués de polyacrylamide (4-8%)
– mesurent plus de 50 cm
– ont une épaisseur variant entre 0.2-0.6 mm
– contiennent de lʼurée (7-9 M)
– sont chauffés à 50-60 oC durant lʼélectrophorèse
– permettent une lecture dʼau plus 500 bases
Quelle méthode est utilisée par les appareils de séquencage moderne plutôt que les gels de séquence?
l’électrophorèse dans des tubes capillaires
Combien de bases peuvent être lus par les tubes capillaires?
1000 bases
Par quoi les produits de réaction de séquencage sont détectés lorsque l’ADN est marqué avec un isotope radioactif?
Par autoradiographie
Dans les technique manuelle, quand l’électrophorès est-elle interrompue?
Lorsque les plus courtes chaines d’ADN atteignent la base du gel
Vrai ou faux
Les appareils de séquencage automatisés peuvent séparer l’ensemble des produits de réaction dans seulement 2 puits ou un capillaire
Faux, 1 seul puit, un seul capillaire
Comment les appareils de séquencage automatisés peuvent séparer les produits de réaction dans un seul capillaire?
ddNTPs couplés avec des colorants qui émettent de la fluorescence à différentes longueurs d’onde (une pour chaque base)
Comment sont représentées les données générées par les séquenceurs automatisés?
Comment s’appelle cette représentation?
Sous forme graphique
Électrochromatogramme
Quelles sont les ADN polymérases les plus utilisées de nos jours?
Des versions modifiées de l’AmpliTaq ne possédant pas d’activité exonucléase 5’->3’
Pourquoi l’AmpliTaq a-t-elle été modifiée?
Parce qu’elle produit un bruit de fond important
Pour quoi ont été développées les AmpliTaq CS et FS?
Pour le séquencage d’ADN à l’aide de séquenceurs automatisés
Quelle est la différence entre l’AmpliTaq CS et FS?
FS permet de lire plus de bases et moins d’enzyme est nécessaire pour la réaction
CS et FS sont…
3 caractéristiques communes
très processives, actives entre 70-90C, produisent des pics de fluorescence d’intensité plus uniforme
Que permet la thermostabilité de FS et CS?
Séquencer des régions ayant de fortes structures secondaires, d’utiliser des conditions plus strictes pour l’hybridation avec l’amorce, de séquencer l’ADN par la méthode de cycle sequencing
Vrai ou faux
Les ADN pol CS et FS incorporent plus facilement les dNTPs que les ddNTPs
Faux, incorporent presque aussi facilement les ddNTPs
Quelles sont les caractéristiques des amorces pour le séquencage d’ADN?
- oligonucléotides de synthèse (18-29 mères)
- contenu en G/C de 40-50%
- Séquences sont complémentaires à une séquence spécifique de la matrice d’ADN
Quelles sont les gabarits utilisés pour le séquencage d’ADN?
- ADNsb provenant de clones M13 ou de phagemides recombinants
- ADN double-brin provenant de plasmides, cosmides, clones lambda, et produits PCR
Vrai ou faux
C’est parce que le type de gabarits de clones M13 et de phagemides a été requis pendant plusieurs années pour le séquencage que ceux-ci ont été créer
Vrai
Quel développement a permis l’utilisation d’ADN double-brin dénaturé?
le cycle sequencing
Que contient chaque cycle de cycle sequencing?
les étapes qui caractérisent la PCR :
- dénaturation (96)
- Appariement de l’amorce (50)
- Élongation en présence d’un ddNTP et de quatre dNTPs (60)
Chaque cycle de cycle sequencing entraîne la formation…
d’une nouvelle chaîne d’ADN se terminant avec un ddNTP à partir de chaque molécule utilisée comme gabarit
Lors du cycle sequencing, les signaux de séquence sont amplifiés ______, ce qui permet d’obtenir…
linéairement,
Des séquences à partir d’une très petite quantité de gabarit
Une réaction de séquence permet de déterminer la séquence de combien de bases consécutives?
400-1000
Vrai ou faux
Il est possible de séquencer des fragments de plus de 800-2000 pb au moyen d’une amorce s’appariant au vecteur de chaque côté de l’insertion
Faux
Comment oobtient-on une séquence de longs segments d’ADN?
– En effectuant des réactions de séquences avec un grand
nombre de sous-fragments différents ou en utilisant un grand
nombre dʼamorces différentes
Quelles sont les deux apporches permettant de séquencer de longs fragments d’ADN?
Laquelle demande une carte physique?
- Approche aléatoire (pas carte physique
2. Approche systématique (carte physique souvent requise)
Que requiert l’apporche aléatoire?
Des logiciels puissants pour le traitement des données
Décrire brievement l’approche aléatoire
Cette approche implique le séquençage dʼun grand nombre de sous-fragments clonés au hasard et nécessite un ordinateur et des logiciels puissants pour assembler le grand volume de données de séquences. On séquence suffisamment de sous-fragments pour couvrir six fois la longueur du génome ou de la région à séquencer
Vrai ou faux
Les séquences répétées présentent un problème majeur pour le séquencage par la méthode systématique
Faux, pour la méthode aléatoire
Une variante de l’approche aléatoire implique…
le clonage d’une série de longs fragments qui se chevauchent
D’ou proviennent les longs fragments pour la «clone contigs approach»?
D’une banque de BAC
Comment fonctionne la «clone contigs approach»?
Les fragments sont séquencés séparément par l’approche aléatoire, puis la séquence complète du génome est assemblée en utilisant les recoupement entre les fragments
Que permet de simplifier la «clone contigs approach»
La problématique d’assemblage des grands génomes contenant des séquences répétées
Quelles sont les trois stratégies pouvant être utilisée lors de l’approche systématique?
- Séquençage de sous-fragments définis dont
les positions relatives sont connues (une
carte physique est donc essentielle) - Utilisation d’une série d’amorces spécifiques
au fragment à séquencer - Séquençage d’une série de sous-fragments
obtenus par délétions séquentielles du
fragment d’intérêt
Décrire la stratégie d’utilisation d’une série d’amorces spécifiques au fragment à séquencer.
• Un fragment cloné est séquencé en plusieurs étapes à lʼaide dʼune série dʼamorces • Une première réaction permet dʼobtenir la séquence dʼune région de 400-1000 bases à lʼextrémité du fragment • A partir de la séquence obtenue, on prépare un oligonucléotide qui servira dʼamorce pour une deuxième réaction de séquence. Cette dernière permettra de lire les bases adjacentes à la première séquence • Lʼétape précédente est répétée jusquʼà ce que la séquence du fragment soit complète
Vrai ou faux
La bio-informatique joue un rôle essentiel dans les projets de séquencage
Vrai
Quelles sont les fonctions des logiciels d’analyse de séquence?
– Assembler les séquences
– Identifier/Déterminer :
• les sites de reconnaissance pour les enzymes de
restriction
• les positions des gènes et des cadres de lecture
ouverts
• les motifs dans les séquences d’acides aminés
• l’utilisation de codons
• les poids moléculaires des protéines codées
• les structures secondaires d’ARN et des
protéines
• l’homologie des séquences nouvellement
déterminées avec celles déjà consignées dans
les banques de données
