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Ch.7 Le séquencage d'ADN Flashcards

1
Q

Quelles sont les quatres étapes du séquencages par la méthode de sanger?

A
  1. Réaction de séquencage
  2. Électrophorèse des produits de réaction sur gel de séquence
  3. Détection des fragments d’ADN
  4. Lecture de la séquence
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Q

Quel est le résultat de l’incorporation d’un didésoxyribonucléotide dans une chaine d’ADN en réplication?

A

Bloque la croissance de cette chaine

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3
Q

Les réactions de séquençage génèrent ________ qui partagent une extrémité commune et qui différent…

A 
Les réactions de 
séquençage génèrent 
une série de chaînes 
dʼADN simple-brin qui 
partagent une 
extrémité commune et 
qui différent à l'autre 
extrémité pour chaque 
base successive
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4
Q

Dans quelle condition le séquencage d’ADN peut être effectué dans un seul tube?

A

Lorsque les chaines terminées par différents ddNTPs peuvent être distinguées

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5
Q

Comment fait-on pour distinguerles bases aux extrémités des chaines?

A

Chaque ddNTP doit être couplé avec un colorant qui émet une fluorescence à une longueur d’onde qui lui est propre

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6
Q

Les gels de séquence peuvent séparer des chaines d’ADNsb dont les longueurs ne diffèrent…

A

que par une seule base

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7
Q

Quelles sont les caractéristiques des gels de séquence?

A

– sont constitués de polyacrylamide (4-8%)
– mesurent plus de 50 cm
– ont une épaisseur variant entre 0.2-0.6 mm
– contiennent de lʼurée (7-9 M)
– sont chauffés à 50-60 oC durant lʼélectrophorèse
– permettent une lecture dʼau plus 500 bases

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8
Q

Quelle méthode est utilisée par les appareils de séquencage moderne plutôt que les gels de séquence?

A

l’électrophorèse dans des tubes capillaires

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9
Q

Combien de bases peuvent être lus par les tubes capillaires?

A

1000 bases

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10
Q

Par quoi les produits de réaction de séquencage sont détectés lorsque l’ADN est marqué avec un isotope radioactif?

A

Par autoradiographie

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11
Q

Dans les technique manuelle, quand l’électrophorès est-elle interrompue?

A

Lorsque les plus courtes chaines d’ADN atteignent la base du gel

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12
Q

Vrai ou faux
Les appareils de séquencage automatisés peuvent séparer l’ensemble des produits de réaction dans seulement 2 puits ou un capillaire

A

Faux, 1 seul puit, un seul capillaire

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13
Q

Comment les appareils de séquencage automatisés peuvent séparer les produits de réaction dans un seul capillaire?

A

ddNTPs couplés avec des colorants qui émettent de la fluorescence à différentes longueurs d’onde (une pour chaque base)

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14
Q

Comment sont représentées les données générées par les séquenceurs automatisés?
Comment s’appelle cette représentation?

A

Sous forme graphique

Électrochromatogramme

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15
Q

Quelles sont les ADN polymérases les plus utilisées de nos jours?

A

Des versions modifiées de l’AmpliTaq ne possédant pas d’activité exonucléase 5’->3’

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16
Q

Pourquoi l’AmpliTaq a-t-elle été modifiée?

A

Parce qu’elle produit un bruit de fond important

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17
Q

Pour quoi ont été développées les AmpliTaq CS et FS?

A

Pour le séquencage d’ADN à l’aide de séquenceurs automatisés

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18
Q

Quelle est la différence entre l’AmpliTaq CS et FS?

A

FS permet de lire plus de bases et moins d’enzyme est nécessaire pour la réaction

19
Q

CS et FS sont…

3 caractéristiques communes

A

très processives, actives entre 70-90C, produisent des pics de fluorescence d’intensité plus uniforme

20
Q

Que permet la thermostabilité de FS et CS?

A

Séquencer des régions ayant de fortes structures secondaires, d’utiliser des conditions plus strictes pour l’hybridation avec l’amorce, de séquencer l’ADN par la méthode de cycle sequencing

21
Q

Vrai ou faux

Les ADN pol CS et FS incorporent plus facilement les dNTPs que les ddNTPs

A

Faux, incorporent presque aussi facilement les ddNTPs

22
Q

Quelles sont les caractéristiques des amorces pour le séquencage d’ADN?

A
  • oligonucléotides de synthèse (18-29 mères)
  • contenu en G/C de 40-50%
  • Séquences sont complémentaires à une séquence spécifique de la matrice d’ADN
23
Q

Quelles sont les gabarits utilisés pour le séquencage d’ADN?

A
  • ADNsb provenant de clones M13 ou de phagemides recombinants
  • ADN double-brin provenant de plasmides, cosmides, clones lambda, et produits PCR
24
Q

Vrai ou faux

C’est parce que le type de gabarits de clones M13 et de phagemides a été requis pendant plusieurs années pour le séquencage que ceux-ci ont été créer

25
Quel développement a permis l'utilisation d'ADN double-brin dénaturé?
le cycle sequencing
26
Que contient chaque cycle de cycle sequencing?
les étapes qui caractérisent la PCR : - dénaturation (96) - Appariement de l'amorce (50) - Élongation en présence d'un ddNTP et de quatre dNTPs (60)
27
Chaque cycle de cycle sequencing entraîne la formation...
d'une nouvelle chaîne d'ADN se terminant avec un ddNTP à partir de chaque molécule utilisée comme gabarit
28
Lors du cycle sequencing, les signaux de séquence sont amplifiés ______, ce qui permet d'obtenir...
linéairement, | Des séquences à partir d'une très petite quantité de gabarit
29
Une réaction de séquence permet de déterminer la séquence de combien de bases consécutives?
400-1000
30
Vrai ou faux Il est possible de séquencer des fragments de plus de 800-2000 pb au moyen d'une amorce s'appariant au vecteur de chaque côté de l'insertion
Faux
31
Comment oobtient-on une séquence de longs segments d'ADN?
– En effectuant des réactions de séquences avec un grand nombre de sous-fragments différents ou en utilisant un grand nombre dʼamorces différentes
32
Quelles sont les deux apporches permettant de séquencer de longs fragments d'ADN? Laquelle demande une carte physique?
1. Approche aléatoire (pas carte physique | 2. Approche systématique (carte physique souvent requise)
33
Que requiert l'apporche aléatoire?
Des logiciels puissants pour le traitement des données
34
Décrire brievement l'approche aléatoire
``` Cette approche implique le séquençage dʼun grand nombre de sous-fragments clonés au hasard et nécessite un ordinateur et des logiciels puissants pour assembler le grand volume de données de séquences. On séquence suffisamment de sous-fragments pour couvrir six fois la longueur du génome ou de la région à séquencer ```
35
Vrai ou faux | Les séquences répétées présentent un problème majeur pour le séquencage par la méthode systématique
Faux, pour la méthode aléatoire
36
Une variante de l'approche aléatoire implique...
le clonage d'une série de longs fragments qui se chevauchent
37
D'ou proviennent les longs fragments pour la «clone contigs approach»?
D'une banque de BAC
38
Comment fonctionne la «clone contigs approach»?
Les fragments sont séquencés séparément par l'approche aléatoire, puis la séquence complète du génome est assemblée en utilisant les recoupement entre les fragments
39
Que permet de simplifier la «clone contigs approach»
La problématique d'assemblage des grands génomes contenant des séquences répétées
40
Quelles sont les trois stratégies pouvant être utilisée lors de l'approche systématique?
1. Séquençage de sous-fragments définis dont les positions relatives sont connues (une carte physique est donc essentielle) 2. Utilisation d'une série d'amorces spécifiques au fragment à séquencer 3. Séquençage d'une série de sous-fragments obtenus par délétions séquentielles du fragment d'intérêt
41
Décrire la stratégie d'utilisation d'une série d'amorces spécifiques au fragment à séquencer.
``` • Un fragment cloné est séquencé en plusieurs étapes à lʼaide dʼune série dʼamorces • Une première réaction permet dʼobtenir la séquence dʼune région de 400-1000 bases à lʼextrémité du fragment • A partir de la séquence obtenue, on prépare un oligonucléotide qui servira dʼamorce pour une deuxième réaction de séquence. Cette dernière permettra de lire les bases adjacentes à la première séquence • Lʼétape précédente est répétée jusquʼà ce que la séquence du fragment soit complète ```
42
Vrai ou faux | La bio-informatique joue un rôle essentiel dans les projets de séquencage
Vrai
43
Quelles sont les fonctions des logiciels d'analyse de séquence?
– Assembler les séquences – Identifier/Déterminer : • les sites de reconnaissance pour les enzymes de restriction • les positions des gènes et des cadres de lecture ouverts • les motifs dans les séquences d'acides aminés • l'utilisation de codons • les poids moléculaires des protéines codées • les structures secondaires d'ARN et des protéines • l'homologie des séquences nouvellement déterminées avec celles déjà consignées dans les banques de données

ADN recombinant (8 decks)

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