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ADN recombinant > Ch.7 Le séquencage d'ADN > Flashcards

Ch.7 Le séquencage d'ADN Flashcards

1
Q

Quelles sont les quatres étapes du séquencages par la méthode de sanger?

A
  1. Réaction de séquencage
  2. Électrophorèse des produits de réaction sur gel de séquence
  3. Détection des fragments d’ADN
  4. Lecture de la séquence
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Q

Quel est le résultat de l’incorporation d’un didésoxyribonucléotide dans une chaine d’ADN en réplication?

A

Bloque la croissance de cette chaine

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3
Q

Les réactions de séquençage génèrent ________ qui partagent une extrémité commune et qui différent…

A 
Les réactions de 
séquençage génèrent 
une série de chaînes 
dʼADN simple-brin qui 
partagent une 
extrémité commune et 
qui différent à l'autre 
extrémité pour chaque 
base successive
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4
Q

Dans quelle condition le séquencage d’ADN peut être effectué dans un seul tube?

A

Lorsque les chaines terminées par différents ddNTPs peuvent être distinguées

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5
Q

Comment fait-on pour distinguerles bases aux extrémités des chaines?

A

Chaque ddNTP doit être couplé avec un colorant qui émet une fluorescence à une longueur d’onde qui lui est propre

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6
Q

Les gels de séquence peuvent séparer des chaines d’ADNsb dont les longueurs ne diffèrent…

A

que par une seule base

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7
Q

Quelles sont les caractéristiques des gels de séquence?

A

– sont constitués de polyacrylamide (4-8%)
– mesurent plus de 50 cm
– ont une épaisseur variant entre 0.2-0.6 mm
– contiennent de lʼurée (7-9 M)
– sont chauffés à 50-60 oC durant lʼélectrophorèse
– permettent une lecture dʼau plus 500 bases

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8
Q

Quelle méthode est utilisée par les appareils de séquencage moderne plutôt que les gels de séquence?

A

l’électrophorèse dans des tubes capillaires

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9
Q

Combien de bases peuvent être lus par les tubes capillaires?

A

1000 bases

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10
Q

Par quoi les produits de réaction de séquencage sont détectés lorsque l’ADN est marqué avec un isotope radioactif?

A

Par autoradiographie

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11
Q

Dans les technique manuelle, quand l’électrophorès est-elle interrompue?

A

Lorsque les plus courtes chaines d’ADN atteignent la base du gel

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12
Q

Vrai ou faux
Les appareils de séquencage automatisés peuvent séparer l’ensemble des produits de réaction dans seulement 2 puits ou un capillaire

A

Faux, 1 seul puit, un seul capillaire

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13
Q

Comment les appareils de séquencage automatisés peuvent séparer les produits de réaction dans un seul capillaire?

A

ddNTPs couplés avec des colorants qui émettent de la fluorescence à différentes longueurs d’onde (une pour chaque base)

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14
Q

Comment sont représentées les données générées par les séquenceurs automatisés?
Comment s’appelle cette représentation?

A

Sous forme graphique

Électrochromatogramme

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15
Q

Quelles sont les ADN polymérases les plus utilisées de nos jours?

A

Des versions modifiées de l’AmpliTaq ne possédant pas d’activité exonucléase 5’->3’

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16
Q

Pourquoi l’AmpliTaq a-t-elle été modifiée?

A

Parce qu’elle produit un bruit de fond important

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17
Q

Pour quoi ont été développées les AmpliTaq CS et FS?

A

Pour le séquencage d’ADN à l’aide de séquenceurs automatisés

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18
Q

Quelle est la différence entre l’AmpliTaq CS et FS?

A

FS permet de lire plus de bases et moins d’enzyme est nécessaire pour la réaction

19
Q

CS et FS sont…

3 caractéristiques communes

A

très processives, actives entre 70-90C, produisent des pics de fluorescence d’intensité plus uniforme

20
Q

Que permet la thermostabilité de FS et CS?

A

Séquencer des régions ayant de fortes structures secondaires, d’utiliser des conditions plus strictes pour l’hybridation avec l’amorce, de séquencer l’ADN par la méthode de cycle sequencing

21
Q

Vrai ou faux

Les ADN pol CS et FS incorporent plus facilement les dNTPs que les ddNTPs

A

Faux, incorporent presque aussi facilement les ddNTPs

22
Q

Quelles sont les caractéristiques des amorces pour le séquencage d’ADN?

A
  • oligonucléotides de synthèse (18-29 mères)
  • contenu en G/C de 40-50%
  • Séquences sont complémentaires à une séquence spécifique de la matrice d’ADN
23
Q

Quelles sont les gabarits utilisés pour le séquencage d’ADN?

A
  • ADNsb provenant de clones M13 ou de phagemides recombinants
  • ADN double-brin provenant de plasmides, cosmides, clones lambda, et produits PCR
24
Q

Vrai ou faux

C’est parce que le type de gabarits de clones M13 et de phagemides a été requis pendant plusieurs années pour le séquencage que ceux-ci ont été créer

A

Vrai

25
Q

Quel développement a permis l’utilisation d’ADN double-brin dénaturé?

A

le cycle sequencing

26
Q

Que contient chaque cycle de cycle sequencing?

A

les étapes qui caractérisent la PCR :

  • dénaturation (96)
  • Appariement de l’amorce (50)
  • Élongation en présence d’un ddNTP et de quatre dNTPs (60)
27
Q

Chaque cycle de cycle sequencing entraîne la formation…

A

d’une nouvelle chaîne d’ADN se terminant avec un ddNTP à partir de chaque molécule utilisée comme gabarit

28
Q

Lors du cycle sequencing, les signaux de séquence sont amplifiés ______, ce qui permet d’obtenir…

A

linéairement,

Des séquences à partir d’une très petite quantité de gabarit

29
Q

Une réaction de séquence permet de déterminer la séquence de combien de bases consécutives?

A

400-1000

30
Q

Vrai ou faux

Il est possible de séquencer des fragments de plus de 800-2000 pb au moyen d’une amorce s’appariant au vecteur de chaque côté de l’insertion

A

Faux

31
Q

Comment oobtient-on une séquence de longs segments d’ADN?

A

– En effectuant des réactions de séquences avec un grand
nombre de sous-fragments différents ou en utilisant un grand
nombre dʼamorces différentes

32
Q

Quelles sont les deux apporches permettant de séquencer de longs fragments d’ADN?
Laquelle demande une carte physique?

A
  1. Approche aléatoire (pas carte physique

2. Approche systématique (carte physique souvent requise)

33
Q

Que requiert l’apporche aléatoire?

A

Des logiciels puissants pour le traitement des données

34
Q

Décrire brievement l’approche aléatoire

A 
Cette approche implique le 
séquençage dʼun grand nombre 
de sous-fragments clonés au 
hasard et nécessite un 
ordinateur et des logiciels 
puissants pour assembler le 
grand volume de données de 
séquences.
On séquence suffisamment de 
sous-fragments pour couvrir six 
fois la longueur du génome ou 
de la région à séquencer
35
Q

Vrai ou faux

Les séquences répétées présentent un problème majeur pour le séquencage par la méthode systématique

A

Faux, pour la méthode aléatoire

36
Q

Une variante de l’approche aléatoire implique…

A

le clonage d’une série de longs fragments qui se chevauchent

37
Q

D’ou proviennent les longs fragments pour la «clone contigs approach»?

A

D’une banque de BAC

38
Q

Comment fonctionne la «clone contigs approach»?

A

Les fragments sont séquencés séparément par l’approche aléatoire, puis la séquence complète du génome est assemblée en utilisant les recoupement entre les fragments

39
Q

Que permet de simplifier la «clone contigs approach»

A

La problématique d’assemblage des grands génomes contenant des séquences répétées

40
Q

Quelles sont les trois stratégies pouvant être utilisée lors de l’approche systématique?

A
  1. Séquençage de sous-fragments définis dont
    les positions relatives sont connues (une
    carte physique est donc essentielle)
  2. Utilisation d’une série d’amorces spécifiques
    au fragment à séquencer
  3. Séquençage d’une série de sous-fragments
    obtenus par délétions séquentielles du
    fragment d’intérêt
41
Q

Décrire la stratégie d’utilisation d’une série d’amorces spécifiques au fragment à séquencer.

A 
• Un fragment cloné est séquencé en 
plusieurs étapes à lʼaide dʼune série 
dʼamorces
• Une première réaction permet dʼobtenir
la séquence dʼune région de 400-1000 
bases à lʼextrémité du fragment
• A partir de la séquence obtenue, on 
prépare un oligonucléotide qui servira 
dʼamorce pour une deuxième réaction de 
séquence. Cette dernière permettra de 
lire les bases adjacentes à la première 
séquence
• Lʼétape précédente est répétée jusquʼà 
ce que la séquence du fragment soit
complète
42
Q

Vrai ou faux

La bio-informatique joue un rôle essentiel dans les projets de séquencage

A

Vrai

43
Q

Quelles sont les fonctions des logiciels d’analyse de séquence?

A

– Assembler les séquences
– Identifier/Déterminer :
• les sites de reconnaissance pour les enzymes de
restriction
• les positions des gènes et des cadres de lecture
ouverts
• les motifs dans les séquences d’acides aminés
• l’utilisation de codons
• les poids moléculaires des protéines codées
• les structures secondaires d’ARN et des
protéines
• l’homologie des séquences nouvellement
déterminées avec celles déjà consignées dans
les banques de données

ADN recombinant (8 decks)

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